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目的
研究缺氧诱导因子1-α(hypoxicinduciblefactor-1α，HIF-1α)在青光眼大鼠视网膜的表达及其信号调控机制，探讨青光眼视网膜缺血缺氧时视网膜细胞自我保护的机制。
方法
1.通过前房灌注平衡盐液建立不同眼压水平的大鼠急性青光眼模型：
灌注持续时间均为4小时，依据前房灌注压的不同将SD大鼠25只随机分为正常对照组(A组)、40mmHg灌注组(B组)、60mmHg灌注组(C组)、80mmHg灌注组(D组)、100mmHg灌注组(E组)；正常对照组不给予前房灌注，其他各组分别给予不同的前房灌注压。正常对照组和各组灌注结束后快速摘除眼球，剥离视网膜，提取视网膜总蛋白，用Westernblot法和/或免疫组织化学法检测视网膜促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、HIF-1α、磷酸化糖原合成激酶-3β(p-GSK(Ser-9))和磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(P-ERK1/2)的表达。灌注过程中使用台式血压计直接监测眼内压。
2.通过前房灌注平衡盐液建立高眼压持续不同时间的大鼠急性青光眼模型：
前房灌注压相同均为80mmHg，依据灌注的持续时间不同随机将20只SD大鼠分为正常对照组(F组)、2小时灌注组(G组)、4小时灌注组(H组)、8小时灌注组(Ⅰ组)；正常对照组不给予前房灌注，其他各组采取前房灌注的方法均给予相同的灌注压，但灌注时间各异。正常对照组和各灌注组灌注结束后快速摘除眼球，用Westernblot法和/或免疫组织化学法检测视网膜EPO、HIF-1α、p-GSK-3β(Ser-9)和p-ERK1/2的表达。灌注过程中使用台式血压计直接监测眼内压。
3.用Westernblot法检测大鼠视网膜目的蛋白：
目的蛋白(EPO、HIF-1α、p-GSK-3β(Ser-9)和p-ERK1/2)表达的相对量用Westernblot法获得的目的蛋白表达灰度与内参蛋白的表达灰度之比来表示。EPO、HIF-1α和p-GSK-3β(Ser-9)的内参蛋白是β-actin，p-ERK1/2的内参蛋白是t-ERK1/2。
4.表达目的蛋白的大鼠视网膜细胞的定位：
用免疫组织化学方法对表达目的蛋白的大鼠视网膜细胞进行定位。
结果
1.前房灌注时大鼠眼压的监测：
该实验的全部个体的眼内灌注压(单位：mmHg)与台式血压计读数(单位：mmHg)进行比较，进行配对t检验，两者差异没有统计学意义(d=0.7±0.2738mmHg，P＞0.05)。说明台式血压计可以准确监测眼内灌注压。
2.青光眼大鼠视网膜HIF-1α的表达：
在相同灌注持续时间(4小时)条件下，正常对照组、40mmHg组、60mmHg组、80mmHg组和100mmHg组视网膜HIF-1α/β-actin灰度比值分别为：0.8936±0.0415、1.2299±0.0565、1.4240±0.06745、1.4759±0.0586和0.1922±0.0102；与正常对照组相比，40mmHg、60mmHg、80mmHg各组大鼠视网膜HIF-1α的表达均增加(P＜0.01)，但100mmHg组的表达减少(P＜0.01)；说明高眼压视网膜缺氧严重时大鼠视网膜细胞HIF-1α的表达增加，但眼压极高、缺氧极严重时HIF-1α的表达反而下降。在相同的灌注压力(80mmHg)条件下，正常对照组、2小时组、4小时组和8小时组视网膜HIF-1α/β-actin灰度比值分别为：0.9404±0.4988、1.0348±0.5873、1.2442±0.0721和1.3989±0.0732；与正常对照组相比，2小时组HIF-1α的表达未见明显增加(P＞0.05)，4小时组表达增加(P＜0.01)；8小时组比4小时组HIF-1α的表达未见进一步增加(P＞0.05)。说明大鼠视网膜的HIF-1α表达随着缺氧时间的延长而增加。
3.青光眼大鼠视网膜p-GSK-3β(Ser-9)表达：
在相同灌注持续时间(4小时)条件下，正常对照组、40mmHg组、60mmHg组、80mmHg组和100mmHg组视网膜p-GSK-3β(Ser-9)/β-actin灰度比值分别为：1.0431±0.0516、1.3358±0.0671、1.5255±0.0662、1.3384±0.0608和0.7355±0.0356。与正常对照组相比，40mmHg组视网膜的p-GSK-3β(Ser-9)表达增加；与40mmHg组相比，60mmHg组和80mmHg组视网膜的p-GSK-3β(Ser-9)表达增加(P＜0.01)；100mmHg组视网膜p-GSK-3β(Ser-9)的表达较以上各组少(P＜0.01)；说明高眼压视网膜缺氧严重时大鼠视网膜细胞p-GSK-3β(Ser-9)的表达增加，但当眼压极高、视网膜缺氧极严重时p-GSK-3β(Ser-9)的表达反而下降。在相同的眼内灌注压(80mmHg)条件下，正常对照组、2小时组、4小时组和8小时组视网膜p-GSK-3β(Ser-9)/β-actin灰度比值分别为：0.9029±0.0423、1.0288±0.0453、1.2325±0.0636和1.2061±0.0576。随着灌注时间的延长p-GSK-3β(Ser-9)的表达逐渐增加(P＜0.01)。说明大鼠视网膜p-GSK-3β(Ser-9)的表达随着缺氧时间的延长而增加。
4.青光眼大鼠视网膜p-ERK1/2的表达：
在相同的灌注时间(4小时)条件下，正常对照组、40mmHg组、60mmHg组、80mmHg组和100mmHg组视网膜p-ERK1/2/t-ERK1/2灰度比值分别为：0.7988±0.0398、0.7887±0.4015、1.0462±0.0512、1.3153±0.0589和1.5554±0.6128；与正常对照组相比，40mmHg组的p-ERK1/2表达没有增加(P＞0.05)，60mmHg组、80mmHg组和100mmHg组大鼠视网膜的表达依次增加(P＜0.01)，说明高眼压视网膜缺氧严重时大鼠视网膜细胞p-GSK-3β(Ser-9)的表达增加。在相同的眼内灌注压(80mmHg)条件下，正常对照组、2小时组、4小时组和8小时组视网膜p-ERK1/2/t-ERK1/2灰度比值分别为：0.6269±0.0315、0.6926±0.032、0.8896±0.0432和1.26±0.0721；与正常对照组相比，随着灌注时间的延长，各组p-ERK1/2的表达依次增加(P＜0.01)。说明大鼠视网膜p-ERK1/2的表达随着高眼压、视网膜缺氧时间的延长而增加。
5.青光眼大鼠视网膜EPO的表达：
在相同的灌注时间(4小时)条件下，正常对照组、40mmHg组、60mmHg组、80mmHg组和100mmHg组视网膜EPO/β-actin灰度比值分别为：0.98±0.0487、1.3257±0.0712、1.4529±0.0724、1.1788±0.0642和0.7899±0.0389；40mmHg组、60mmHg组、80mmHg组与对正常照组相比大鼠视网膜EPO的表达明显增加(P＜0.01)，100mmHg组与其他各组比明显减少(P＜0.01)；说明高眼压视网膜缺氧严重时大鼠视网膜细胞EPO的表达增加，但眼压极高、视网膜缺氧极严重时EPO的表达反而下降。在相同的眼内灌注压(80mmHg)条件下，正常对照组、2小时组、4小时组和8小时组视网膜EPO/β-actin灰度比值分别为：0.9687±0.0465、1.1057±0.0546、1.2560±0.0612和1.3262±0.0687；与对正常照组相比灌注2小时组EPO的表达无明显增加(P＞0.05)，4小时组、8小时组表达均增加(P＜0.05)。说明大鼠视网膜EPO的表达随着高眼压、视网膜细胞缺氧时间的延长而增加。
6.大鼠视网膜表达HIF-1α和EPO的细胞的定位：
用免疫组织化学检查可见表达HIF-1α和EPO的视网膜细胞主要位于神经节细胞层，部分位于内核层。
结论
1.使用台式血压计可以准确监测大鼠眼内灌注压。
2.随着眼压升高、视网膜缺氧的加重和缺氧时间的延长，大鼠视网膜HIF-1α的表达增加，但当眼压极度升高、视网膜缺氧极度严重时它的表达反而下降。
3.高眼压视网膜缺氧时大鼠视网膜细胞能够通过GSK-3β对HIF-1α的表达进行调节。
4.高眼压视网膜缺氧时大鼠视网膜细胞能够通过HIF-1α对EPO的表达进行调节。
5.表达HIF-1α和EPO的大鼠视网膜细胞主要位于视神经节细胞层，部分位于内核层。
6.高眼压大鼠视网膜HIF-1α表达的增加有力地支持了青光眼视神经损害的缺氧学说。