【摘 要】
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膀胱癌是人体泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。传统治疗膀胱癌的方法,如膀胱切除术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法等虽然取得一定的成效,但由于存在肿瘤细胞远距离迁移、高复发率、以及对正常组织毒副作用等缺点,使得研发新型抗击膀胱癌药物成为当务之急。PPM-18是一种新型的维生素K类似物,目前发现其生物学功能主要体现在抑制斑马鱼癫痫的发生及在体外抑制白血病细胞活力。然而,PPM-18是否像维生素K一样具有显
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膀胱癌是人体泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。传统治疗膀胱癌的方法,如膀胱切除术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法等虽然取得一定的成效,但由于存在肿瘤细胞远距离迁移、高复发率、以及对正常组织毒副作用等缺点,使得研发新型抗击膀胱癌药物成为当务之急。PPM-18是一种新型的维生素K类似物,目前发现其生物学功能主要体现在抑制斑马鱼癫痫的发生及在体外抑制白血病细胞活力。然而,PPM-18是否像维生素K一样具有显著的抑癌功能还有待进一步研究。因此本研究旨在探索PPM-18对膀胱癌的治疗作用。主要研究内容和结果如下:（1）PPM-18在体外抑制膀胱癌细胞的增殖通过分析细胞活力,发现PPM-18以浓度和时间依赖的方式降低人膀胱癌细胞活力。通过Brd U和细胞克隆实验,发现PPM-18能够显著抑制膀胱癌细胞增殖。体外实验中PPM-18表现出广谱的抑癌作用并且对正常细胞无明显抑制效应。（2）PPM-18诱导膀胱癌细胞的凋亡和自噬通过流式细胞术和Western blot实验显示,PPM-18能够有效诱导膀胱癌细胞凋亡并且伴随线粒体膜电势降低,表明其诱导膀胱癌细胞凋亡是由线粒体通路介导的。通过Western blot和透射电镜实验,发现PPM-18能够显著激活膀胱癌细胞自噬。在经自噬抑制剂3-methyladenine（3-MA）和Chloroquine（CQ）处理后,PPM-18诱导膀胱癌细胞自噬和凋亡的现象受到明显抑制,而经自噬激动剂Rapamycin处理后能显著增加PPM-18诱导的膀胱癌细胞凋亡,说明PPM-18激活膀胱癌细胞自噬可促进凋亡。此外,PPM-18在一定浓度范围内对人正常细胞无显著自噬和凋亡效应,表明正常细胞对PPM-18的处理不敏感。（3）PPM-18通过激活AMPK依赖的自噬促进膀胱癌细胞凋亡通过Western blot实验,发现PPM-18能够显著激活膀胱癌细胞内AMPK信号通路,相反,与AMPK相拮抗的PI3K/AKT/m TORC1信号通路在经PPM-18处理之后受到明显抑制。通过抑制AMPK发现PPM-18诱导膀胱癌细胞自噬和凋亡的程度受到显著减弱,表明PPM-18诱导的膀胱癌细胞自噬和凋亡是AMPK依赖的。（4）PPM-18通过激活ROS/AMPK通路调控膀胱癌细胞的凋亡和自噬流式细胞仪检测发现PPM-18能够增加膀胱癌细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平。在经ROS清除剂N-acetyl-L-cysteine（NAC）、Glutathione（GSH）和Vitamin E（VE）处理后,PPM-18诱导的膀胱癌细胞自噬和凋亡水平被有效抑制。PPM-18激活AMPK、抑制PI3K/AKT/m TORC1信号通路的现象随着ROS的清除而发生明显逆转。以上结果表明,PPM-18可上调ROS水平,造成细胞内氧化压力,进而激活AMPK以及抑制PI3K/AKT/m TORC1信号通路,导致膀胱癌细胞自噬和凋亡。在探索PPM-18上调膀胱癌细胞内ROS水平的机制方面,发现经过PPM-18处理的膀胱癌细胞对培养基中葡萄糖的消耗能力受到明显抑制,并且释放到培养基中的乳酸（糖酵解终产物）含量也显著降低,表明PPM-18能够有效抑制膀胱癌细胞糖酵解途径。相反,PPM-18的处理能够促进膀胱癌细胞内ATP的合成,并导致线粒体ROS急剧上升,表明PPM-18能够有效激活膀胱癌细胞线粒体氧化磷酸化过程。（5）PPM-18在体内抑制膀胱癌的生长通过测量裸鼠皮下瘤体积,发现PPM-18能够显著抑制人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长。通过免疫组化和TUNEL实验,发现PPM-18能够在裸鼠体内诱导膀胱癌细胞自噬和凋亡。并且在荷瘤裸鼠中证实了PPM-18激活AMPK,上调ROS水平的现象。H＆E染色结果显示PPM-18对裸鼠的心、肝、脾、肺、肾没有明显的毒副作用,且在整个给药期间内,PPM-18对荷瘤裸鼠的体重没有显著影响,说明PPM-18具有良好的生物安全性。综上所述,该项研究发现PPM-18作为一种新型的维生素K类似物,能够在体外和体内有效抑制膀胱癌细胞增殖,诱导ROS/AMPK通路依赖的膀胱癌细胞自噬和凋亡,且具有良好的生物安全性。该研究成果为研发新型抗击膀胱癌药物提供新思路,为PPM-18临床应用治疗膀胱癌提供可行性和必要的理论基础。
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