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前言:喉癌是一种起源于喉部粘膜上皮组织的恶性肿瘤,是全球第二大常见的头颈部恶性肿瘤。与多数肿瘤一样,喉癌也是多种因素共同作用的结果,包括环境和遗传因素。尽管有多种积极的治疗干预措施,但喉癌新发病例仍呈上升趋势,患者的5年生存率并没有根本的改善。因此,在分子水平研究喉癌发生发展机制仍是目前喉癌研究的重点和难点,将有助于发现喉癌早期诊断和治疗的分子靶标,具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。众所周知,肿瘤源于异常细胞的过度增殖,细胞增殖与凋亡水平失衡是肿瘤发生发展的重要原因之一,其失衡程度可决定肿瘤发展的速度。可见,细胞增殖与凋亡机制研究是目前肿瘤发生发展分子机制研究的一个重要内容。MYCT1(Myc Target 1)是本课题组应用电子杂交和分子生物学方法从喉癌组织中克隆的新的候选抑癌基因。本课题组前期研究表明,转染MYCT1的喉癌Hep2细胞凋亡水平显著增加,增殖和侵袭能力显著降低,提示MYCT1在喉癌中发挥抑癌基因作用。然而,其如何促进喉癌细胞凋亡的分子机制仍需进一步研究。在构建稳转MYCT1表达的喉癌细胞基础上,我们通过RNA-seq技术发现了包括NPM1在内的一系列与细胞凋亡相关的差异表达基因。NPM1编码核仁磷蛋白,是一种穿梭蛋白,穿梭于细胞核和细胞质之间。研究表明,NPM1除构成核仁外,还可以通过细胞外的死亡受体通路和细胞内的线粒体通路调控肿瘤细胞凋亡等生物学过程。同时,本课题组前期研究发现NPM1是miR-181a靶基因之一,并检测了二者在喉癌中分子生物学功能,但有关MYCT1是否参与其调控未见相关报道。通过生物信息学软件预测,我们发现MYCT1与MAX存在潜在相互作用,且miR-181a是MAX的潜在靶基因。MAX基因编码产物为MYC相关因子10(MYC-associated factor X,MAX),是一转录因子,也是碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix leucine zipper,bHLHZ)家族成员。研究发现,MAX可通过调节多种靶基因转录表达调控包括肿瘤细胞凋亡在内的多种生物学过程,而MAX是否在喉癌细胞凋亡中发挥作用尚不明确。综上,我们推测MYCT1可能通过调控MAX、miR-181a和NPM1三者所在的信号网络介导喉癌细胞凋亡,这也是本研究的主要研究目标和创新之处。因此,本研究拟采用相关分子生物学技术检测NPM1在喉癌细胞凋亡中的作用,并鉴定MYCT1、MAX和miR-18la各基因间相互关系;探讨MYCT1是否通过MAX、、和iR-181a和NPM1信号轴经死亡受体通路和线粒体通路介导喉癌细胞凋亡。材料与方法:1、实验材料:人胚肾细胞系HEK293T、人喉癌细胞系Hep2和喉癌及相应癌旁组织标本。2、实验方法:细胞培养、Real-time PCR检测、基因瞬时转染实验、Western blot检测、荧光素酶报告基因活性检测、染色质免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫荧光实验、流式细胞术检测、CCK-8细胞增殖能力检测、克隆形成检测、Caspase活性检测及统计分析。结果:1、Real-time PCR和Western blot结果显示,NPM1在喉癌组织中表达水平较癌旁组织显著增高(P<0.05),而且,其表达水平受MYCT1负向调控(P<0.05)。2、CCK-8与克隆形成实验结果表明,与对照组相比,NPM1过表达组可有效增强Hep2细胞增殖及克隆形成能力(P<0.05);相反,抑制NPM1表达则有效抑制Hep2细胞增殖及克隆形成能力(P<0.05)。3、流式细胞术检测凋亡结果表明,与对照组相比,抑制NPM1表达可有效促进Hep2细胞早期凋亡(P<0.05),而过表达NPM1后无显著差异(P>0.05)。4、生物信息学软件预测结果显示,MYCT1与MAX存在潜在相互作用。免疫共沉淀结果表明,在Hep2细胞中MYCT1可与MAX蛋白发生相互作用。5、免疫荧光结果表明,与对照组相比,过表达MYCT1可增强MYCT1与MAX蛋白在喉癌Hep2细胞核中共定位,提示过表达MYCT1可促进MAX入核。6、生物信息学软件预测结果显示,miR-181a基因启动子区存在MAX潜在结合位点。Real-time PCR结果显示,敲减MAX可显著下调miR-181a表达水平(P<0.05)。7、染色质免疫沉淀结果表明,MAX能与miR-181a基因启动子结合,且敲减MAX后显著降低MAX与该启动子的结合能力(P<0.05)。8、荧光素酶报告基因活性检测结果显示,敲减M4X或MYCT1能够显著降低miR-181a基因启动子区转录活性(P<0.05),提示MAX可直接促进miR-181a基因转录。9、Real-time PCR结果显示,miR-181a在喉癌组织中表达水平较癌旁组织显著降低(P<0.05),而且,其表达水平受MYCT1正向调控(P<0.05)。10、CCK-8与克隆形成实验结果表明,与对照组相比,抑制miR-181a表达可有效促进Hep2细胞增殖及克隆形成能力(P<0.05);相反,miR-181a过表达组则有效降低Hep2细胞增殖与克隆形成能力(P<0.05),且过表达NPM1能显著回复miiR-181a对上述功能的影响(P<0.05)。11、流式细胞术检测凋亡结果表明,与对照组相比,抑制miR-181a表达可有效抑制Hep2细胞早期凋亡(P<0.05);相反,过表达miR-181a则有效促进Hep2细胞早期凋亡(P<0.05),且过表达NPM1能显著回复miR-181a对细胞早期凋亡的影响(P<0.05)。12、CCK-8与克隆形成实验结果表明,与对照组相比,过表达MYCT1可有效抑制Hep2细胞增殖与克隆形成能力(P<0.05),而过表达NPM1或敲减miR-181a均能显著回复MYCT1对上述功能的影响(P<0.05)。13、流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,与对照组相比,MYCT1过表达组可有效促进喉癌Hep2细胞早期凋亡(P<0.05),而过表达NPM1或敲减miR-181a均能显著回复MYCT1对早期凋亡的影响(P<0.05)。14、Capase活性检测和Western blot结果显示,与对照组相比,过表达MYCT1可显著升高Caspase相关蛋白活性及表达(P<0.05),而过表达NPM1或敲减miR-181a均能显著回复MYCT1对凋亡通路相关蛋白活性及表达水平的影响(P<0.05)。结论:1、NPM1在喉癌中高表达,并与MYCT1表达水平呈负相关,NPM1促进Hep2细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示其在喉癌中发挥癌基因作用。2、MYCT1可与MAX发生蛋白相互作用,二者主要共定位于Hep2细胞核。3、MAX作为转录因子可与miR-181a启动子区结合并促进其转录活性。4、miR-181a在喉癌中低表达,与MYCT1表达水平呈正相关并可通过NPM1抑制喉癌细胞增殖,促进细胞凋亡。5、MYCT1通过与MAX结合促进miR-181a表达,进而抑制NPM1表达,经死亡受体通路和线粒体通路促进喉癌细胞凋亡。