【目的】干扰素α(IFNα)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的疗效具有个体化差异,本课题拟从筛选与IFNα疗效相关的单核苷酸多态性(SNP)位点和挖掘疗效相关的差异表达基因两个方面入手,寻找与IFNα疗效相关的SNP位点或基因以预测其临床疗效,并通过细胞学实验进一步探讨它们影响IFNα抗乙型肝炎病毒(HBV)作用的机制,以期为预测CHB患者IFNα的疗效奠定基础,实现精准诊疗。【方法】1.收集124例HBV基因型为B/C的HBeAg阳性CHB患者,其中IFNα治疗完全应答(CR)组38例,应答不佳(SR)组86例。用Infinium?Asian Screening Array(ASA)和Massarray技术对IFNα通路内/外的基因进行SNP分型,统计出在CR/SR组中分布有差异的位点;用实时荧光定量PCR法检测具有差异SNPs的基因在不同应答组和不同基因型中的m RNA表达量;观察不同基因型与IFNα治疗过程中的HBV DNA、HBs Ag和HBeAg水平的关系;探讨不同基因型对IFNα诱导抗病毒蛋白和干扰素刺激基因(ISGs)表达的影响。2.从GEO Data Sets上查找用IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者肝组织m RNA芯片,通过聚类分析、GO功能注释和KEGG通路富集,挖掘出不同疗效组间的差异表达基因;在HepG2细胞中验证HBV对差异基因表达的影响;构建干扰和过表达基因的慢病毒载体,作用于HepG2.2.15细胞后观察HBV的复制情况;加入IFNα刺激,观察IFNα信号通路中信号传导及转录活化因子1(STAT1)和STAT2蛋白的磷酸化水平是否发生改变以及抗病毒蛋白—寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、干扰素刺激基因—泛素特异性多肽酶18(USP18)等的表达情况。【结果】1.APOB、ZNF350/ZNF350-AS1基因多态性与IFNα的疗效有关1.1.确定APOB rs1367117、APOB rs10199768、ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420和ZNF350-AS1 rs6509607为研究对象124例样本用Asian Screening Array和Massarray法检测出483500个位点。通过卡方检验和数据的多重检验校正,得到P<0.05的位点23672个,P<0.01的位点4381个(基因1265个),P<10-5的位点51个(基因20个)。实时荧光定量PCR检测P<10-5的基因和锌指蛋白(ZNF)家族基因的m RNA,ZNF350基因的m RNA在SR组[40.98(17.43-64.93)]中的表达高于CR组[15.62(10.99-25.68)],差异具有统计学意义(P=0.018)。载脂蛋白B(APOB)的蛋白表达量在CR/SR组中有统计学差异(P<0.05)。确定APOB rs1367117、APOB rs10199768、ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420和ZNF350-AS1 rs6509607为目的研究对象。1.2.rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607四个位点的基因型与IFNα的疗效有关rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607的基因型在CR/SR组之间的分布具有统计学差异(P=0.029,P=0.036,P=0.000和P=0.000);SR组中的rs1367117 GG基因型和G等位基因频率显著高于CR组(P=0.021和P=0.017);SR组中的rs10199768 CC基因型和C等位基因频率显著高于CR组(P=0.036和P=0.040)。SR组中的rs2278420 AA基因型和A等位基因频率显著高于CR组(P<0.001和P<0.001);SR组中的rs6509607 AA基因型和A等位基因频率显著高于CR组(P<0.001和P<0.001)。1.3.rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607不同基因型患者的实验室指标随IFNα治疗过程的变化情况观察IFNα治疗的第12、24、36、48周。HBV DNA、HBs Ag和HBeAg在APOB rs1367117 GG型和AG型患者之间的分布没有显著差异。在治疗12周时APOB rs10199768 AC型患者的HBeAg浓度较CC型低(P=0.017)。单倍型分析显示,IFNα治疗第12周和第24周时rs1367117A/rs10199768A患者的HBeAg浓度较rs1367117G/rs10199768C患者低(P=0.033和P=0.023),和A基因型与CR相关的结果一致。在IFNα治疗12周、36周和48周时ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420 AG型患者的HBeAg浓度较AA型低(P=0.007,P=0.002和P=0.024)。在IFNα治疗12周、36周时ZNF350-AS1 rs6509607 AG型患者的HBeAg浓度较AA型低(P=0.016和P=0.002)。单倍型分析显示,在IFNα治疗12周、36周和48周时,rs2278420G/rs6509607G患者的HBeAg浓度都较rs2278420A/rs6509607A患者低(P=0.007,P=0.002和P=0.029),和G基因型与CR相关的结果一致。1.4.APOB和ZNF350基因多态性位点的相关功能学实验在探索rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607不同基因型影响IFNα抗病毒的机制中,未经任何抗病毒治疗的HBV感染者PBMC在IFNα作用后,用实时荧光定量PCR法检测IFNα信号通路基因、ISGs和抗病毒蛋白的m RNA在不同基因型感染者中的表达情况。rs10199768 AC型感染者的STAT1和CXCL10的m RNA表达水平较CC型高(P=0.002和P=0.027);单倍型分析结果显示,rs1367117A/rs10199768 A感染者的STAT1、CXCL10和ISG15的表达水平较rs1367117G/rs10199768C高(P=0.004,P=0.044和P=0.020),与A等位基因与CR有关的结果一致。同样的,rs2278420 AA型感染者的IFNα通路负调控基因SOCS1、SOCS3和PIAS1表达水平较AG型高(P=0.017,P=0.011和P=0.010);rs6509607 AA型感染者的PIAS1、PTPN6的表达水平较AG型高(P=0.022,P=0.004和P=0.041),与A等位基因与SR有关的结果一致。2.LCK基因表达差异影响HBeAg阳性CHB患者IFNα疗效2.1.通过基因芯片挖掘差异表达基因对IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者肝组织m RNA表达芯片GSE27555(应答vs.应答不佳)和GSE66698(治疗前vs.治疗后)进行数据挖掘和分析后,筛选出淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)基因。2.2.HBV DNA与LCK表达有相互促进作用培养液加入CHB患者血清(HBV DNA>106 IU/ml)促进HepG2细胞中LCK的表达(P=0.010)。进一步探究发现,在HepG2细胞中,重组HBs Ag(r HBs Ag)对LCK表达无影响(P>0.05),而r AAV1.3HBV可显著促进LCK的表达(P=0.008)。对Hep AD38细胞进行LCK的过表达后,上清液中HBs Ag和HBeAg含量升高(P<0.001和P=0.002)。2.3.LCK抑制抗病毒蛋白表达体外应用IFNα刺激LCK干扰后的HepG2.2.15细胞,发现干扰素基因刺激蛋白(STING)、含三角形四肽重复序列的干扰素诱导蛋白3(IFIT3)、干扰素刺激基因15(ISG15)、腺苷脱氨酶(ADAR)、ISG20、OAS1、USP18基因的m RNA表达增高(P值均小于0.05),而过表达LCK时无显著差异;同时Western-blot法检测到过表达LCK后OAS1蛋白的表达降低,干扰LCK后OAS1、USP18和ISG15蛋白表达增高。进一步探究LCK作用于IFNα信号通路的机制中发现,LCK过表达时STAT1和STAT2蛋白磷酸化水平降低。【结论】1.APOB和ZNF350/ZNF350-AS1基因多态性与IFNα治疗HBeAg阳性CHB患者的疗效有关:rs1367117和rs10199768携带次要等位基因A与IFNα疗效呈正相关;rs2278420和rs6509607携带次要等位基因G与IFNα疗效呈正相关,有助于在治疗前筛选出对IFNα应答较好的患者。2.LCK促进HBV复制、抑制IFNα应答:LCK基因表达与HBV复制相互促进,LCK通过抑制STAT1和STAT2蛋白磷酸化下调抗病毒蛋白OAS1的表达,对IFNα的抗HBV作用具有抑制作用。