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功能性便秘(Functional constipation,FC)是一种临床常见的功能性胃肠病,但是其病理生理机制至今仍未完全清楚。自1988年起开始出现便秘与情绪问题的相关性研究报道。大量临床观察数据显示,便秘患者多伴有焦虑、抑郁等情绪异常,而情绪异常也常与便秘呈共病状态。但是便秘与情绪问题的关系仍不明了。功能性便秘是针灸临床的优势病种,大肠俞、募穴更是针灸治疗胃肠道疾病的经典腧穴。在我国开展的多项FC临床随机对照试验表明,两穴单用或配伍使用能够增加患者的排便次数、改善大便性状、提高结肠的肠电幅值及频率,同时改善患者的精神心理状态。穴位配伍不仅是针灸处方的重要组成部分,也是针灸疗效的关键环节。不同腧穴配伍针刺作用机制如何(协同、拮抗),效应靶向有无重叠,作用位点有何异同,探索这些机理对针刺理论和临床研究具有重要价值。目的:1.从转录组学层面探讨功能性便秘的分子发病机制。2.从转录组学层面揭示穴位配伍治疗功能性便秘的分子疗效机制。研究方法:1.FC大鼠结肠、海马组织病理形态学观察:雄性SD大鼠26只随机分为2组:空白对照组12只、模型制作组14只。采用复方地芬诺酯混悬液灌胃法复制功能性便秘大鼠模型,随后进行模型成功判定。空白对照组和判定成功模型大鼠通过HE染色、免疫组化、图像采集分析等手段,观察两组大鼠结肠、海马组织形态学变化,以及BDNF蛋白表达情况。2.俞募配穴治疗FC大鼠肠道运动效应研究:雄性SD大鼠36只,随机分为2组:空白对照组6只、模型制作组30只。造模和模型判定方法同实验一。对判定成功模型大鼠再随机分为模型组、俞募组、俞穴组、募穴组。俞募组、俞穴组、募穴组大鼠选取单侧天枢和/或大肠俞,每日左右交替针刺,进针后接电针15-20min,1次/d,连续治疗10d。空白对照组与模型组大鼠同法束缚,不给予针刺干预。干预结束次日取材,观察各组大鼠一般情况、24h排便粪粒数、24h粪便含水量。3.俞募配伍治疗FC大鼠结肠组织差异基因表达分析:雄性SD大鼠50只,随机分为2组:空白对照组、模型制作组。造模和模型判定方法同“实验一”。对判定成功模型大鼠再随机分为模型组、俞募组、俞穴组、募穴组。干预操作均同“实验二”。每组大鼠随机选取6例结肠组织,随后提取总RNA、打断扩增、构建DNA文库、采用BGI-500测序仪对样本进行基因表达谱筛选。对筛选出的显著差异基因进行聚类分析、GO功能富集分析、pathway富集分析。4.俞募配伍治疗FC大鼠海马组织差异基因表达分析:同步提取“实验三”中各组大鼠海马组织总RNA、打断扩增、构建DNA文库,采用BGI-500测序仪对样本进行基因表达谱筛选。对筛选出的显著差异基因进行聚类分析、GO功能富集分析、pathway富集分析。5.俞募配穴治疗FC大鼠海马组织差异基因定量分析:对“实验四”中有深入研究价值的基因采用qRT-PCR技术进行定量分析。结果:1.HE染色结果:空白对照组vs模型组结肠组织,黏膜上皮细胞脱落(2 vs 1)、黏膜下层淋巴管水肿(1 vs 1)、黏膜下层淋巴管扩张(0 vs 4),各病变类型发生率差异无统计学意义(P>0.05);两组大鼠海马组织结构分层清晰、神经元细胞、椎体细胞结构完整,未见到异常组织病理学改变。2.BDNF免疫组化结果:与空白对照组比较,模型组各区BDNF阳性累计光密度均有不同程度减少,其中CA3、DG区差异具有统计学意义(P<0.05)。3.俞募配伍治疗FC大鼠肠运动效应观察:①24h排便粪粒数:与模型组相比,俞募组、俞穴组、募穴组数值均有所增加,其中募穴组差异有统计学意义(P<0.05);三个电针组组间差异无统计学意义(P>0.05)。②24h粪便含水量:与模型组相比,俞募组、俞穴组、募穴组数值均有所增加,但差异均无统计学意义(P>0.05);三个电针组组间差异无统计学意义(P>0.05)。4.俞募配穴治疗FC大鼠结肠组织差异基因表达分析:①与空白组相比,模型组显著性差异基因61个,下调27个,上调34个。GO功能富集和pathway的富集结果一致表明,FC对结肠位点的影响以脂类代谢为主,其次影响细胞进程,此外差异基因还显著富集在PI3K-Akt信号通路、P53压力信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及免疫反应等;②与模型组相比,俞募组显著性差异基因12个,GO功能富集主要围绕免疫反应及脂蛋白调节,但富集基因数仅2个,pathway没有显著性富集(P>0.05);③募穴组显著性差异基因43个,GO功能富集和pathway富集结果表明,募穴组主要通过促进肠道平滑肌运动发挥效应功能(P<0.05),相关基因包括肌球蛋白轻链基因、肌动蛋白基因、钙调结合蛋白基因;④俞穴组显著性差异基因18个,GO功能和pathway均无显著性富集(P>0.05)。5.俞募配穴治疗FC大鼠海马组织差异基因表达分析:①与空白组相比,模型组显著性差异基因36个,下调14个,上调22个,GO功能富集主要表现为氧化应激应答,pathway显著富集在胆碱能突触1条生物学通路;②与模型组相比,俞募组显著性差异基因48个,GO功能富集主要表现为调节氧化应激应答、抗氧化等方面,pathway显著富集于胆汁分泌1条生物学通路(P<0.05);③募穴组显著性差异基因9个,显著性富集在5-羟色胺能突触1条生物学通路(P<0.05);④俞穴组显著性差异基因19个,pathway显著性富集在戊糖和葡萄糖醛酸脂相互转换1条生物学通路(P<0.05)。6.qRT-PCR基因定量结果:模型组和俞募组Igf2 mRNA、Enpp2 mRNA、Igfbp2 mRNA、KI、Ptgds mRNA相对表达量结果与测序结果吻合,其中两组Enpp2 mRNA、Igfbp2 mRNA、KI mRNA 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.功能性便秘对海马具有病理改变,主要表现为对血管及血液携氧功能的改变,以及海马胆碱能系统的异常,上述改变可能是造成情绪异常状态的直接或间接的原因之一。2.俞募配伍治疗FC结肠位点效应机制:①俞穴治疗FC局部效应不明确,差异表达基因虽以调节免疫功能为主,但整体功能分布较散乱,靶向性不明确;②募穴治疗FC局部效应肯定,通过促进平滑肌细胞多个基因表达,发挥促进肠道收缩运动功能;③俞募组治疗FC局部效应介于二者之间,主要表现在免疫调节及脂蛋白调节。3.俞募配伍治疗FC海马位点作用机制:①俞穴治疗FC对海马作用主要体现为携氧功能的改善;②募穴治疗FC对海马作用包括对血管及血液正常生理功能保护性作用和影响5-羟色胺神经递质含量与释放,但富集到的差异基因数目较少,该作用证据强度仍有待验证。③俞募组治疗FC对海马作用在三个针刺组中最显著,主要体现改善携氧功能、抗血管钙化样作用和改善认知样作用。