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目的:探究低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）对牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells,PDLSCs）增殖活性、凋亡及成骨分化能力的影响,初步探讨信号素3A（Semaphorin 3A,Sema3A）在低氧刺激下对PDLSCs成骨分化的作用。方法:一、分离提取并鉴定PDLSCs:采用组织块法结合酶消化法分离提取PDLSCs并对其进行鉴定,使用茜素红S（Alizarin red S,ARS）染色、油红O染色对所提取的PDLSCs进行多向分化潜能的鉴定;用流式细胞术检测所提取细胞表面的间充质干细胞标志物CD29、CD90以及造血干细胞标志物CD31、CD45;采用集落形成实验检测细胞的单克隆集落形成能力。二、建立体外低氧模型:用氯化钴（Cobalt chloride,CoCl2）模拟体外低氧环境,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞上清液的OD值,以此反映细胞中HIF-1α的表达水平。然后用CCK-8法检测CoCl2对细胞增殖活性的影响,流式细胞术和Western Blot对CoCl2刺激下细胞凋亡率和凋亡相关蛋白（Caspase-3和Bcl-2）进行检测。三、检测HIF-1α对PDLSCs成骨能力的影响:采用上述实验所筛选出较合适的CoCl2浓度进行Western Blot和RT-PCR检测PDLSCs中成骨相关标志物m RNA和蛋白表达水平,包括成骨特异性转录因子（Runt related transcription factor 2,RUNX2）,骨钙素（Osteocalcin,OCN）,Ⅰ型胶原蛋白α1链（alpha-1 type 1collagen,COL1A1）和Sema3A。进一步用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色检测细胞ALP的阳性表达情况,并用ARS染色检测矿化结节的形成。随后,在CoCl2刺激的基础上加入HIF-1α的抑制剂芹菜素对PDLSCs处理3天,用Western Blot和RT-PCR分别检测PDLSCs成骨相关标志物和Sema3A的蛋白及m RNA表达水平。四、检测Sema3A对低氧下PDLSCs成骨分化的影响:在CoCl2刺激下加入400 ng/m L外源性重组蛋白Sema3A对PDLSCs处理3天,Western Blot和RT-PCR检测成骨相关标志物m RNA和蛋白的表达量,并用ALP染色和ARS染色分别检测7天和21天时PDLSCs的成骨分化情况。两组样本之间采用独立样本t检验进行比较。多组间差异分析采用单因素方差分析。使用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析。结果:一、分离提取并鉴定PDLSCs:对所提取的细胞进行ARS染色,结果可见细胞形成大量红色不规则矿化结节;油红O染色显示细胞间有橙红色脂滴形成,证明了细胞的成骨和成脂分化能力。流式细胞术结果显示该细胞CD29表达率为99.52%、CD90表达率为96.74%、CD31表达率为0.76%、CD45表达率为0.64%。集落形成实验镜下可见＞50个PDLSCs的细胞集落形成。二、建立低氧模型:CCK-8检测结果表明,200、300和400μM CoCl2处理组会抑制细胞活性（p＜0.001）;而空白对照组、50和100μM CoCl2处理组在4天内对细胞活性影响无明显差异（p＞0.05）,但在4天后会增强细胞活性（p＜0.001）。流式细胞术结果表明,CoCl2处理组的凋亡率与空白对照组相比无显著性差异（p＞0.05）;同时,Western Blot结果也显示经过CoCl2处理后细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达量与对照组相比无明显差异。ELISA实验显示,50μM CoCl2刺激细胞24小时和72小时,上清液中HIF-1α的蛋白表达显著上调（p＜0.01）,证明体外低氧模型建立成功。三、检测HIF-1α对PDLSCs成骨能力的影响:50μM CoCl2刺激PDLSCs 3天,Western Blot和RT-PCR结果显示RUNX2、COL1A1、OCN和Sema3A的m RNA和蛋白表达均呈显著性下调趋势（p＜0.001）。ARS染色和ALP染色结果显示,长时间HIF-1α刺激下,PDLSCs的矿化结节形成能力和ALP的阳性表达量都会受到明显抑制。用40μM芹菜素对HIF-1α的表达进行抑制,Western Blot和RT-PCR结果显示PDLSCs成骨标志分子RUNX2、OCN及Sema3A的m RNA和蛋白表达均有明显上调（p＜0.01）。四、检测Sema3A对低氧下PDLSCs成骨分化的影响:在CoCl2处理组中加入外源性重组Sema3A蛋白后,Western Blot和RT-PCR结果显示RUNX2、OCN及Sema3A的表达均呈显著性上调（p＜0.01）。ALP染色和ARS染色结果显示,与CoCl2处理组相比,加入外源性重组Sema3A蛋白后ALP和矿化结节明显增多。结论:综上所述,CoCl2诱导的HIF-1α对PDLSCs骨生成的影响呈现浓度和时间依赖性。同时,Sema3A能够显著缓解HIF-1α对PDLSCs骨生成的抑制作用。Sema3A有利于低氧环境下的PDLSCs骨生成,可为低氧环境下的骨再生提供新的治疗思路。