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背景和研究目的:阿尔茨海默病(Alzheimer?s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等因神经元发生不可逆损伤而致神经系统功能障碍的神经退行性疾病(Neurodegenerative disease,NDD),严重危害老年人健康。迄今,其发病机制尚未明确,亦无理想根治疗法,针对这类疾病的新药研发具有重大现实意义。研究发现,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)与神经退行性疾病在神经病理表现及临床治疗方面有着密切的关联,治疗T2DM的药物成为防治NDD的新策略。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)及其类似物作为新型的T2DM的治疗药物,其神经保护作用也日益受到关注。内源性GLP-1极短的半衰期使其不能很好地发挥生理功能,GLP-1类似物等是对天然形式进行修饰的衍生物,其保留了生物活性但却因需静脉注射给患者身体带来负担。为克服上述缺陷,本文以细菌为载体,构建了长效口服型GLP-1补充剂,即两株工程菌-乳酸乳球菌MG1363-pMG36e-GLP-1(原核表达系统)和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-pLIVE-GLP-1(真核表达系统)。研究旨在从多方面、多角度有效地阻止神经退行性疾病的发展。首先,建立了AD小鼠模型,评价两株工程菌单独作用或复合使用的效果,结果表明单独使用MG1363-pMG36e-GLP-1组疗效最佳。然后在PD小鼠模型中,评价了MG1363-pMG36e-GLP-1不同给药剂量以及预防+治疗和单纯治疗的作用效果间的差异,结果显示低剂量给药组疗效更佳,且预防+治疗和单纯治疗并无明显差别。方法一:AD小鼠模型1.两株工程菌株的构建及其体外分泌表达GLP-1的验证。通过基因工程的方法构建MG1363-pMG36e-GLP-1和VNP20009-pLIVE-GLP-1。通过Western-blot和ELISA检测MG1363-pMG36e-GLP-1细菌发酵上清的GLP-1分泌表达量,利用293-T细胞验证VNP20009-pLIVE-GLP-1的真核细胞穿梭能力,之后通过Western-blot和ELISA检测VNP20009-pLIVE-GLP-1在真核细胞培养上清中GLP-1分泌表达量;2.小鼠AD模型的建立。采用8周龄雄性C57BL/6小鼠,分为正常对照组(C组)、模型组(L组)、乳酸乳球菌治疗组(LL组)、减毒鼠伤寒沙门氏菌治疗组(LV组)以及乳酸乳球菌+减毒鼠伤寒沙门氏菌混合菌治疗组(LLV组)五组,每组10只。腹腔注射LPS(0.25 mg/kg/天)连续9天构建小鼠AD模型;3.AD小鼠模型的治疗。造模前2周给予LL组、LV组和LLV组灌胃相应细菌的预防处理,LL组、LV组和LLV组在造模过程中及行为学训练期间均给予灌胃相应细菌的治疗处理,即以上三个处理组的总给药时长为4周。给药方式为MG1363-pMG36e-GLP-1 10~9 CFU/100μL/天,VNP20009-pLIVE-GLP-1 10~7CFU/100μL,隔天给药一次;4.工程菌株对AD小鼠的治疗效果及作用机制。通过行为学实验(巴恩斯迷宫),评价AD小鼠认知功能损伤程度。采用脑组织切片,评价脑组织损伤、神经胶质细胞激活及Aβ蛋白的聚集。应用Western-blot,检测脑组织炎症信号通路(COX-2、TLR-4、NF-κB、MAPKs、PI3K/AKT)蛋白表达。采用q-PCR和ELISA,检测脑组织在转录水平和血清在蛋白水平炎症因子(TNF-α、IL-1β)的表达。结合q-PCR和高通量测序技术分析小鼠肠道微生物的种类和数量的差异。方法二:PD小鼠模型1.小鼠PD模型的建立。采用8周龄雄性C57BL/6小鼠,分为正常对照组(C组)、模型组(M组)、乳酸乳球菌低剂量预防+治疗组(PTL组)、乳酸乳球菌低剂量治疗组(TL组)、乳酸乳球菌高剂量预防+治疗组(PTH组)以及乳酸乳球菌高剂量治疗组(TH组),每组12只。腹腔注射MPTP(20 mg/kg/天)连续1周构建小鼠PD模型;2.PD小鼠模型的治疗。造模前1周给予PTL组和PTH组自由摄取含乳酸乳球菌(不同浓度)的饮水预防处理,PTL组、TL组、PTH组和TH组在造模过程中及行为学训练期间均给予自由摄取含乳酸乳球菌(不同浓度)的饮水的治疗处理,即PTL组和PTH组的给药总时长为2周,TL组和TH组的给药总时长为1周;3.工程菌株对PD小鼠的治疗效果及作用机制。通过行为学实验(旷场实验),评价PD小鼠认知功能损伤程度。采用脑组织切片,评价多巴胺能神经元丢失及神经胶质细胞激活。应用Western-blot,检测脑组织炎症信号通路(GFAP、Iba1、TLR-4、p-NF-κB/NF-κB)蛋白表达及PD相关蛋白(α-syn)聚集。采用q-PCR和ELISA,检测脑组织在转录水平和血清在蛋白水平炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达。通过高通量测序技术,分析小鼠肠道微生物的种类和数量的差异。结合代谢组学分析小鼠肠道代谢物差异。结果一:AD小鼠模型1.巴恩斯迷宫结果显示LL组即单独使用MG1363-pMG36e-GLP-1组的小鼠更能恢复LPS造成的损伤,表现出最接近正常对照组的水平,而无论单独使用VNP20009-pLIVE-GLP-1还是两株菌联用的效果都不及LL组;2.病理学切片得到了同样的结果,LL组即单独使用MG1363-pMG36e-GLP-1组小鼠的脑组织病理损伤(HE染色)、神经炎症细胞的激活(GFAP免疫组化)及Aβ蛋白的聚集(刚果红染色)程度均明显得到恢复;3.Western-blot结果显示LL组即单独使用MG1363-pMG36e-GLP-1组的小鼠下调了脑组织炎症信号通路(COX-2、TLR-4、NF-κB、MAPKs、PI3K/AKT)蛋白的表达,且分别在基因转录水平(q-PCR)和蛋白表达水平(ELISA)抑制了促炎因子(TNF-α、IL-1β)的表达;4.高通量测序结果表明,LL组即单独使用MG1363-pMG36e-GLP-1组最大程度地恢复了LPS造成的肠道菌群的多样性降低、AD致病菌(拟杆菌)丰度增加以及益生菌(乳酸杆菌)的含量减少;q-PCR结果表明,MG1363-pMG36e-GLP-1显著增加了乳酸杆菌的数量,降低了致病菌肠杆菌、梭杆菌、产气荚膜梭菌和拟杆菌的数量。结果二:PD小鼠模型1.旷场实验结果显示低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1对于恢复MPTP造成的小鼠探索和运动能力损伤效果最佳,预防+治疗和单纯治疗的疗效无明显差异;2.病理学切片和Western-blot结果均显示,低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1可抑制多巴胺能神经元合成限速酶的丢失(TH)和胶质细胞的激活(GFAP、Iba1);3.Western-blot结果显示低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1下调了脑组织炎症信号通路(TLR-4、NF-κB)蛋白和PD特征蛋白(α-syn)的表达,且分别在基因转录水平(q-PCR)和蛋白表达水平(ELISA)抑制了促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达;4.高通量测序结果表明,低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1会逆转因MPTP造成的肠道菌群的多样性降低,且形成了不同于正常对照组新的微生物稳态。另外低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1还降低了因MPTP造成的普雷沃氏菌、肠杆菌和大肠杆菌丰度增加,且对于增加人类肠道中最重要的两类益生菌-乳酸杆菌和Akk菌有积极作用;5.最后,各处理组肠道内容物在组成上虽表现出明显差异,但代谢物如醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐、γ-氨基丁酸和甘氨酸的差量无统计学意义。结论一:AD小鼠模型1.MG1363-pMG36e-GLP-1和VNP20009-pLIVE-GLP-1都可成功表达GLP-1;2.MG1363-pMG36e-GLP-1单独作用效果最佳,对LPS诱导的AD小鼠模型具有积极的治疗效果;3.MG1363-pMG36e-GLP-1可改善小鼠空间学习和探索记忆能力损伤,且可抑制Aβ蛋白的聚集和神经胶质细胞的过度激活;4.MG1363-pMG36e-GLP-1通过下调炎症信号通路蛋白COX-2、TLR-4、NF-κB、MAPKs和PI3K/AKT的表达以及降低促炎因子TNF-α和IL-1β在脑组织和血清中的转录和蛋白水平表达而发挥抗炎作用;5.MG1363-pMG36e-GLP-1恢复了因LPS造成的肠道菌群的多样性的降低、AD致病菌的丰度增高和乳酸杆菌含量减少。结论二:PD小鼠模型1.低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1给药方式效果最佳,对MPTP诱导的PD小鼠模型具有积极的治疗效果,且预防+治疗和单纯治疗二者无明显差别;2.低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1可改善小鼠自主运动和探究行为的损伤,且可抑制α-syn蛋白的聚集和神经胶质细胞的过度激活;3.低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1通过下调炎症相关蛋白TLR-4和NF-κB的表达以及降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6在脑组织和血清中的转录和蛋白水平表达而发挥抗炎作用;4.低剂量MG1363-pMG36e-GLP-1逆转了MPTP造成的肠道菌群的多样性的降低且形成了不同于正常对照组新的微生物稳态,对增加人类肠道中最重要的两类益生菌-乳酸杆菌和Akk菌也有积极作用;5.代谢组学结果显示MG1363-pMG36e-GLP-1未对各组间PD相关代谢物表达造成明显影响;6.通过益生菌和效应蛋白的联用可直接(效应蛋白作用)和间接(益生菌恢复肠道菌群稳态)起到治疗疾病的目的,有助于放大治疗效果。