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第一部分: 研究背景和目的:S期激酶相关蛋白2(Skp2)属于原癌蛋白基因,其通过泛素化蛋白酶体途径发挥功能,在细胞多种生物学过程中占有重要的地位。现阶段研究在多种肿瘤中均发现Skp2蛋白的表达增高,且其表达情况与肿瘤患者预后不良明显相关。然而,在人类乳腺癌组织中,对细胞浆中Skp2的表达情况和其作用机制的研究,及其对肿瘤患者预后的影响均尚未有报道。 材料与方法:为了研究人类乳腺癌细胞浆中Skp2的表达情况,本研究选取了251例乳腺浸润性导管癌的患者,利用免疫组织化学的方法,分别检测细胞浆中Skp2、p-Akt1和p27蛋白的表达情况。利用卡方检验和Fisher精确检验方法,分析细胞浆中Skp2和p-Akt1及p27蛋白表达之间的相关性,以及细胞浆中Skp2与乳腺浸润性导管癌各临床病理学参数之间的相关性。利用Kaplan-Meier统计方法和单因素、多因素Cox回归模型分析Skp2胞浆中表达不同的乳腺癌的无病生存期和总生存期的差异。 结果:在251例乳腺癌患者中,165例患者细胞浆中Skp2呈高表达状态,其高表达率为65.7％,且细胞浆中Skp2的高表达与患者肿瘤直径大小、组织学分级以及HER2过表达等明显相关。Spearman相关性分析结果显示,在细胞浆中Skp2的高表达与p-Akt1的高表达呈正相关关系,在94例肿瘤细胞浆低表达p-Akt1的患者中,51例患者细胞浆中Skp2表达阳性,其高表达率为54.2%;而在157例肿瘤细胞浆高表达p-Akt1的患者中,共114例患者细胞浆中Skp2高表达,其高表达率为72.6%。乳腺癌患者肿瘤细胞浆中高表达Skp2合并低表达p-Akt1时,患者的无病生存期及总生存期均较差,单因素及多因素Cox回归模型分析结果显示,细胞浆中Skp2的表达情况是浸润性乳腺癌的独立预后因素。同时我们也分析了细胞核Skp2表达与临床病理学因素的关系,并未发现显著的相关性。 结论:肿瘤细胞浆中Skp2的表达情况与乳腺癌较差的预后因素相关,如肿瘤直径较大,肿瘤分化程度低等。本研究结果提示,合并细胞浆中Skp2和p-Akt1表达情况可作为乳腺浸润性导管癌的新预测患者预后的生物学指标,而Skp2可能成为乳腺癌靶向治疗的新的生物学靶点。 第二部分: 研究背景和目的:microRNA(miRNAs)通过与靶基因的信使RNA(mRNA)的3’非翻译区配对结合后抑制后者的蛋白翻译过程或促进其降解过程。miR-200c参与了细胞的EMT过程,并与肿瘤的远处转移过程密切相关。本研究中主要构建了可以监测miR-200c表达水平的光学报告基因。 材料与方法:不同乳腺癌细胞株中miR-200c的表达量通过Real-TimePCR的方法进行检测。构建质粒在编码融合蛋白Luc2=tdT的cDNA下游3’非翻译区含有三个miR-200c靶序列的重复序列,我们建立了稳定表达融合蛋白Luc2=tdT的细胞系,并利用miR-200c的模拟物或抑制剂,验证两者是否可以调节以上荧光素酶的活性。在稳定转染野生型或持续活化型PAK4的MDA-MB-231细胞中转染报告基因,并检测荧光素酶的活性。 结果:miR-200c在侵袭能力低的乳腺癌细胞株中表达较高。而在转染报告基因系统的细胞中,荧光素酶的活性受miR-200c水平的调控,且miR-200c的表达水平与PAK4的活性相关。 结论:本研究结果显示,所构建的报告基因系统Luc2/tdT_miR-200c_3TS可能是监测miR-200c水平的有效工具,同时可以间接反映肿瘤细胞的EMT过程。miR-200c的上调与PAK4的下调对肿瘤细胞的迁移的抑制具有协同作用。