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背景与目的:蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）是一种临床极其常见的脑血管综合征,在中风类疾病中约占5%,具有急性起病、高致死致残率的特点。以往的研究认为其高致死致残率的原因主要是出血后继发的脑血管痉挛（Cerebral vascular spasm,CVS）,但投入大量研究发现使痉挛物质失活或阻断动脉平滑肌收缩的药物临床收效甚微,死亡率和致残率未见明显下降。最新研究发现,蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（Early brain injury,EBI）才是其高致死致残率的重要原因,但EBI的具体病理机制目前尚不完全清楚,已有的研究发现主要涉及脑缺血、脑水肿、氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡等方面的病理过程,因此,深入研究EBI的病理机制,寻找合适的治疗策略和新靶点对于改善蛛网膜下腔出血后EBI至关重要。CC趋化因子配体20（C-C chemokine ligand 20,CCL20）属于小细胞因子CC亚族,CC趋化因子受体6（CC chemokine receptor 6,CCR6）是其唯一受体。当CCL20与特异性受体CCR6结合后可调节细胞趋化、迁移和炎症,在稳态和炎症条件下的皮肤和粘膜表面以及肿瘤和多种自身免疫性疾病中发挥重要作用。在氧糖剥夺体外实验中,CCL20对原代神经元和少突胶质细胞有直接的毒性作用。在缺血性脑损伤中,CCL20与CCR6的表达均明显上调,而抗CCL20中和抗体可以明显减少脑梗死体积,并且CCL20在组织炎性级联反应中起着关键作用。在脊髓损伤中,CCL20中和抗体有利于运动功能的恢复,并且可以通过降低分泌白介素-1β（Interleukin-1 beta,IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor,TNF-α）来减少炎症反应。此外,CCL20可以通过调节Th17细胞的募集和IL-17A的分泌来加重脊髓损伤后的神经炎症。同时,有研究表明CCL20在SAH后表达明显上调,但CCL20是否参与其早期脑损伤的病理过程,目前还没有相关报道。因此,鉴于CCL20在其他中枢神经系统疾病的生理病理过程中的重要作用,本研究拟通过构建小鼠SAH模型来探讨CCL20在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用和机制。方法:1、构建小鼠蛛网膜下腔出血模型并随机分成7组:sham组、SAH3 h组、SAH 12 h组、SAH 24 h组、SAH 48 h组、SAH 72 h组、SAH96 h组,通过逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）和Western blot实验检测CCL20在蛛网膜下腔出血后各时间点的表达情况;通过免疫荧光实验进一步确定蛛网膜下腔出血后CCL20在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的表达情况。2、构建小鼠蛛网膜下腔出血模型并随机分成6组:sham组、SAH组、SAH+Ig G组、SAH+CCL20阻断抗体浓度1μg/4μl组（SAH+CCL201μg）、SAH+CCL20阻断抗体浓度5μg/4μl组（SAH+CCL20 5μg）、SAH+CCL20阻断抗体浓度7μg/4μl组（SAH+CCL20 7μg）,在SAH24 h和72 h后对各组小鼠神经功能评分和脑水肿程度进行评估。3、构建小鼠蛛网膜下腔出血模型并随机分成5组:sham组、SAH组、SAH+Ig G组、SAH+CCL20阻断抗体浓度5μg/4μl组（SAH+CCL205μg）、SAH+CCL20阻断抗体浓度7μg/4μl组（SAH+CCL20 7μg）,通过TUNEL实验检测各组小鼠脑组织中神经元的凋亡情况;通过免疫荧光实验检测各组小鼠脑组织中小胶质细胞的活化情况。4、体外培养小胶质细胞并分成5组:对照组（con）、oxyhemoglobin处理组（Oxy Hb）、oxyhemoglobin+干扰对照组（Oxy Hb+NC）、oxyhemoglobin+CCL20干扰组（Oxy Hb+CCL20 si RNA）、oxyhemoglobin+CCR6干扰组（Oxy Hb+CCR6 si RNA）,通过RT-PCR和Western blot实验检测CCL20和CCR6在体外模拟的SAH模型中的表达并验证CCL20 si RNA和CCR6 si RNA的干扰效果。同时,通过RT-PCR和Western blot实验检测CCL20和CCR6干扰对oxyhemoglobin诱导的小胶质细胞活化及炎症因子IL-1β和TNF-α表达的影响。5、体外培养小胶质细胞并分成4组:oxyhemoglobin处理组、oxyhemoglobin+干扰对照组、oxyhemoglobin+CCL20干扰组、oxyhemoglobin+CCR6干扰组,并制备条件培养基。体外培养神经元细胞,并在小胶质细胞条件培养基下培养,分成5组:非条件培养基（conditioned medium,CM）组（non-CM）、oxyhemoglobin处理条件培养基组（Oxy Hb CM）、oxyhemoglobin+干扰对照条件培养基组（Oxy Hb+NC CM）、oxyhemoglobin+CCL20干扰条件培养基组（Oxy Hb+CCL20si RNA CM）、oxyhemoglobin+CCR6干扰条件培养基组（Oxy Hb+CCR6si RNA CM）,通过TUNEL实验检测各组神经元的凋亡情况。6、体外培养神经元并分成4组:对照组（con）、oxyhemoglobin处理组（Oxy Hb）、oxyhemoglobin+干扰对照组（Oxy Hb+NC）、oxyhemoglobin+CCL20干扰组（Oxy Hb+CCL20 si RNA）,通过Western blot实验检测CCL20在体外模拟的SAH模型中的表达并验证CCL20si RNA的干扰效果,通过TUNEL实验检测各组神经元的凋亡情况。7、将体外培养的神经元分成3组:oxyhemoglobin处理组（Oxy Hb）、oxyhemoglobin+干扰对照组（Oxy Hb+NC）、oxyhemoglobin+CCL20干扰组（Oxy Hb+CCL20 si RNA）,并制备条件培养基。体外培养小胶质细胞,并在神经元条件培养基下培养,分成4组:非条件培养基组（CM[-]）、oxyhemoglobin处理条件培养基组（CM[+]）、oxyhemoglobin+干扰对照条件培养基组（NC CM[+]）、oxyhemoglobin+CCL20干扰条件培养基组（CCL20 si RNA CM[+]）,通过Western blot实验检测各组小胶质细胞CCR6表达和小胶质细胞活化指标Iba1的表达,同时通过RT-PCR和Western blot实验检测各组小胶质细胞IL-1β和TNF-α的表达。8、体外培养神经元并制备oxyhemoglobin处理条件培养基。将体外培养的小胶质细胞分成四组:CM[-]组、CM[+]组、Oxy Hb条件培养基培养的小胶质细胞干扰对照转染组（CM[+]+NC）、Oxy Hb条件培养基培养的小胶质细胞CCR6干扰转染组（CM[+]+CCR6 si RNA）,通过Western blot实验检测各组小胶质细胞CCR6表达和小胶质细胞活化指标Iba1的表达,同时通过RT-PCR和Western blot实验检测各组小胶质细胞IL-1β和TNF-α的表达。结果:1、CCL20基因和蛋白表达在SAH造模后明显上调,峰值在造模后3h、48h、72h,且在神经元、小胶质细胞上均有明显表达,且在造模后明显提高,而在星形胶质细胞中未检测到表达。2、SAH小鼠造模后,其神经功能缺损提高,给予CCL20中和抗体后在24h、72h两个时间窗均有明显改善;SAH小鼠造模后脑含水量明显提高,给予CCL20中和抗体后在24 h、72 h两个时间窗均有明显改善。3、SAH小鼠造模24 h后,神经元凋亡比例和小胶质细胞活化数量明显提高,给予CCL20中和抗体后神经元凋亡比例和小胶质细胞活化数量均有明显降低。4、oxyhemoglobin能够明显诱导小胶质细胞中CCL20、CCR6和Iba1蛋白的表达,CCL20 si RNA能够明显抑制oxyhemoglobin对CCL20、CCR6和Iba1蛋白的影响;CCR6 si RNA也能够明显抑制oxyhemoglobin对CCR6和Iba1蛋白的影响;oxyhemoglobin能够明显诱导小胶质细胞中IL-6和TNF-αm RNA和蛋白的表达;CCL20 si RNA和CCR6 si RNA能够明显抑制oxyhemoglobin对小胶质细胞中IL-6和TNF-αm RNA和蛋白表达的影响。5、oxyhemoglobin处理的小胶质细胞条件培养基可以明显诱导神经元的凋亡,转染CCL20 si RNA和CCR6 si RNA的小胶质细胞oxyhemoglobin处理组条件培养基培养的神经元凋亡比例明显减少。6、oxyhemoglobin能够明显诱导神经元中CCL20蛋白的表达,CCL20 si RNA能够明显抑制oxyhemoglobin对神经元中CCL20蛋白表达的影响;oxyhemoglobin能够明显诱导神经元的凋亡,但是CCL20si RNA干扰对oxyhemoglobin诱导的神经元凋亡比例没有显著影响。7、oxyhemoglobin处理的神经元条件培养基可以明显诱导小胶质细胞中CCR6和Iba1蛋白的表达,而在神经元中干扰CCL20的表达可以明显回复小胶质细胞中CCR6和Iba1蛋白的表达。oxyhemoglobin处理的神经元条件培养基可以明显诱导小胶质细胞中IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白的表达,而在神经元中干扰CCL20的表达可以明显回复小胶质细胞中IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白的表达。8、在小胶质细胞中干扰CCR6的表达可以明显回复oxyhemoglobin处理的神经元条件培养基诱导的小胶质细胞中CCR6和Iba1蛋白的表达。同时,在小胶质细胞中干扰CCR6的表达可以明显回复oxyhemoglobin处理的神经元条件培养基诱导的小胶质细胞中IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白的表达。结论:CCL20在SAH后在神经元和小胶质细胞中的表达明显上调,并参与炎症反应、神经元凋亡等早期脑损伤的病理过程,抑制其活性可明显抑制炎症反应、神经元凋亡等病理过程,改善EBI后的神经功能障碍。同时,我们发现小胶质细胞来源的CCL20/CCR6信号在激活后可以诱导小胶质细胞活化和神经元凋亡,神经元来源的CCL20可以通过调节小胶质细胞中CCR6的表达来调节其活化和神经元凋亡。