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第一部分RSV感染后期LPS/CpG ODN加重小鼠气道炎症及气道高反应的作用目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是世界范围内5岁以内儿童急性下呼吸道感染（Lower respiratory tract infections,LRTIs）最主要的病毒病原。重症RSV感染与反复喘息及哮喘的发生密切相关。在病毒引起反复喘息的幼儿中常常伴有呼吸道细菌定植,研究发现病毒感染伴随细菌定植可能会影响病情的进展,其具体机制仍不清楚。细菌细胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）及细菌DNA CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligonucleotide,CpG ODN）随病原体生活轨迹广泛分布,且LPS和CpG ODN在细菌被杀灭后还能持续存在较长时间,其通过识别Toll样受体（Toll like receptos,TLRs）进而促进炎症的产生。RSV感染后期病毒已经清除,再遇到LPS及CpG ODN刺激是否会影响RSV感染后期气道炎症并不清楚。因此,本部分通过建立RSV感染后期细菌成分LPS/CpG ODN刺激模型,观察其对气道炎症、气道高反应（Airway hyperresponsiveness,AHR）的影响。方法:选择6-8w龄的Balb/c雌性小鼠,随机分成对照组、CpG组、LPS组、RSV组、RSV+LPS组、RSV+CpG组,每组8-10只;RSV感染第0天,给与对照组、CpG组、LPS组100μl无菌PBS滴鼻,RSV组、RSV+LPS组、RSV+CpG组100μl病毒液滴鼻,监测小鼠体重;RSV感染第35天-41天,每2天（共计4次）给与对照组、RSV组50μl无菌PBS滴鼻,CpG组、RSV+CpG组50μl CpG工作液滴鼻,LPS组、RSV+LPS组50μl LPS工作液滴鼻;RSV感染第42天,监测小鼠肺功能、取支气管肺泡灌洗液（Bronchoalvolarlavage fluid,BALF）、收取小鼠肺组织标本行病理染色。结果:1、RSV+LPS组小鼠体重感染后第36天（P<0.05）、第42天（P<0.05）较对照组明显下降;RSV+CpG组小鼠体重感染后第41天（P<0.01）、第42天（P<0.01）较对照组明显下降;LPS组及CpG组体重与对照组相比没有明显变化。2、大体病理学外观可见仅RSV+CpG组小鼠形成肺组织炎性结节（66.7%）;3、RSV+CpG组及RSV+LPS组在RSV组的基础上,出现明显的肺组织病理损伤,其中以RSV+CpG组更明显,形成炎性结节;RSV+LPS组与RSV相比较细支气管周围炎症（P<0.01）、肺小血管周围炎症（P<0.01）、肺间质炎症（P<0.01）及总体肺组织炎症（P<0.01）显著加重,RSV+CpG组细支气管周围炎症（P<0.0001）、肺小血管周围炎症（P<0.0001）、肺间质炎症（P<0.0001）及总体肺组织炎症（P<0.0001）较对照组、CpG组及RSV组均显著加重;4、低倍镜下观察肺炎性结节,炎症细胞聚集,外周形成泡沫样细胞,组成多个病灶;5、LPS组（P<0.05）、RSV组（P<0.01）、RSV+LPS组（P<0.0001）BALF中炎症细胞总计数较对照组增加;RSV+LPS组较LPS组进一步升高（P<0.01）,其中RSV+LPS组中性粒细胞升高最为显著,高于对照组（P<0.05）、RSV组（P<0.01）;6、RSV组（P<0.01）、RSV+LPS组（P<0.0001）及RSV+CpG组（P<0.01）气道阻力均较对照组显著升高;而RSV+LPS组（P<0.001）及RSV+CpG组（P<0.01）气道阻力均较RSV组进一步升高;RSV+CpG组不仅气道阻力高于RSV+LPS组（P<0.01）,且开始出现气道阻力增加的乙酰胆碱溶液浓度更低（3.125mg/ml）。结论:细菌成分LPS/CpG ODN均显著加重RSV感染后期气道炎症、AHR;而CpG ODN诱发的肺组织炎症、AHR更为严重,可导致炎性结节形成。第二部分LPS通过ERK/MMP-12加重RSV感染后期小鼠气道炎症及气道高反应目的:上部分研究结果表明RSV感染后期细菌成分LPS可以显著加重气道炎症及AHR。课题组前期研究结果发现:基质金属蛋白酶家族（Matrix metalloproteinases,MMPs）尤其是基质金属蛋白酶12（Matrix metalloproteinase 12,MMP-12）部分介导了RSV感染相关的气道炎症、AHR。且有研究报道,MAPK家族成员细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）参与调控MMP-12的产生。故本部分通过特异性抑制剂阻断ERK,观察其是否介导了RSV感染后期LPS刺激后MMP-12的产生及气道炎症、AHR的加重。方法:选择6-8w龄的Balb/c雌性小鼠,随机分成对照组、LPS组、RSV组、RSV+LPS组、RSV+LPS+SB203580组、RSV+LPS+SP600125组及RSV+LPS+PD98059组,每组8-10只;RSV感染第0天,对照组、LPS组给与100μl无菌PBS滴鼻,RSV组、RSV+LPS组、RSV+LPS+SB203580组、RSV+LPS+SP600125组及RSV+LPS+PD98059组给与100μl病毒液滴鼻;RSV感染第35天-41天,RSV+LPS+SB203580组小鼠给与p38抑制剂SB203580,RSV+LPS+SP600125组小鼠给与JNK抑制剂SP600125,RSV+LPS+PD98059组小鼠给与ERK抑制剂PD98059,每天1次（第35天2次,共8次）;同时,RSV感染第35天-41天,对照组、RSV组给与50μl无菌PBS滴鼻,LPS组、RSV+LPS组、RSV+LPS+SB203580组、RSV+LPS+SP600125组及RSV+LPS+PD98059组给与50μl LPS工作液滴鼻,每2天（共计4次）;RSV感染第42天,检测肺功能、取BALF检测MMP-12表达水平、取小鼠肺组织做病理染色、Western Blot检测p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK蛋白表达水平。结果:1、RSV+LPS组小鼠肺组织磷酸化ERK（p-ERK）水平较RSV组显著增高（P<0.001）;RSV+LPS+PD98059组p-ERK表达水平显著降低（P<0.0001）;2、RSV+LPS组小鼠BALF中MMP-12表达水平较RSV组及LPS组显著增高（P<0.01）,予以ERK特异性抑制PD98059处理后BALF中MMP-12表达水平显著降低（P<0.05）;RSV+LPS+SP600125组及RSV+LPS+SB203580组BALF中MMP-12表达水平与RSV+LPS组相比较无明显差异;3、RSV感染Balb/c小鼠第42天,肺组织病理损伤未完全恢复到正常;RSV+LPS组出现明显的肺组织病理损伤:细支气管周围炎症（P<0.05）、肺间质炎症（P<0.01）及总体肺组织炎症（P<0.05）高于RSV组;予以ERK特异性抑制剂PD98059处理后,肺组织病理损伤显著低于RSV+LPS组;4、RSV+LPS组小鼠BALF炎症细胞计数显著升高:BALF炎症细胞总计数（P<0.05）、单核巨噬细胞（P<0.05）、中性粒细胞（P<0.01）高于RSV组;予以ERK特异性抑制剂PD98059处理后,BALF炎症细胞总数及分类计数均显著低于RSV+LPS组;5、RSV+LPS组AHR较RSV组显著增高（P<0.001）;予以ERK特异性抑制剂PD98059处理后AHR较RSV+LPS组显著降低（P<0.0001）。结论:LPS通过活化ERK调控MMP-12的产生,加重RSV感染后期气道炎症、AHR。第三部分CpG ODN通过巨噬细胞及中性粒细胞致RSV感染后期小鼠肺组织炎性结节形成目的:第一部分发现RSV感染后期细菌DNA结构CpG ODN局部刺激可以显著加重气道炎症及AHR,并且形成炎性结节。有研究表明CpG ODN模拟肠道微生物产物转运进入循环系统发挥作用,加重了慢性HBV感染肝组织炎症及损伤。除了模拟细菌成分对组织的影响,局部吸入CpG ODN可以通过抑制Th2类免疫反应减轻哮喘。课题组前期研究表明,RSV感染后期肺组织中存在类似于哮喘的Th2类免疫微环境,并在持续性的气道炎症、AHR中发挥重要作用。但由循环途径转运的CpG ODN是否同样加重RSV感染后期肺组织炎症,诱发肺炎性结节尚不清楚。因此,本研究通过建立RSV感染后期CpG腹腔注射小鼠模型（RSV+CpG ip.）与第一部分中RSV+CpG in.小鼠模型进行对比,观察其是否对RSV感染后期气道炎症、AHR具有保护性效应。第一部分组织病理学显示,CpG ODN刺激诱导RSV感染后期小鼠肺组织炎性结节为泡沫样细胞分布在结节周边包绕着中心的炎症细胞。泡沫细胞是由巨噬细胞吞噬组织中堆积的脂质所形成,而肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar type 2epithelial cells,ATⅡs）通过产生表面活性物质调节肺组织脂代谢稳态。而RSV感染后期CpG ODN吸入诱发小鼠肺组织炎性结节的主要组成及产生过程尚不清楚。因此,本部分中通过对该炎性结节进行染色、荧光标记、流式细胞术检测、透射电镜观察等手段,明确结节细胞组成及可能的形成过程。方法:选择6-8w龄的Balb/c雌性小鼠,随机分成对照组、CpG in.组、CpG ip.组、RSV组、RSV+CpG in.组及RSV+CpG ip.组,每组8-10只;RSV感染第0天,给与对照组、CpG in.组、CpG ip.组100μl无菌PBS滴鼻,RSV组、RSV+CpG in.组及RSV+CpG ip.组100μl病毒液滴鼻;RSV感染第35天-41天,每2天（共计4次）给与对照组、RSV组50μl无菌PBS腹腔注射/滴鼻,CpG ip.组、RSV+CpG ip.组50μl CpG工作液腹腔注射,CpG in.组、RSV+CpG in.组50μl CpG工作液滴鼻;RSV感染第42天,检测肺功能、取BALF、取小鼠肺组织做病理染色、PAS染色及Oil Red O染色;HE染色高倍镜下观察泡沫样细胞、炎症细胞;免疫荧光染色,以CD68作为巨噬细胞标志,SPC作为ATⅡs标志,软件分别统计各组CD68、SPC的荧光强度及平均荧光强度进行比较;取小鼠全肺组织,流式细胞术检测肺组织各类细胞含量,采用分群标记为:T淋巴细胞（CD45+CD3+）、B淋巴细胞（CD45+CD19+）、NK细胞（CD45+CD49+）、中性粒细胞（CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C-）、巨噬细胞（CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C+）、间质巨噬细胞（CD45+F4/80+CD11c+）、ATⅡs（SPC+）;取小鼠左肺叶上极,4%戊二醛固定,送电镜室行透射电镜观察拍照。结果:1、RSV+CpG ip.组小鼠体重变化与RSV组一致;CpG in.组及CpG ip.组体重与对照组相比没有明显变化;RSV+CpG ip.组未见肺组织炎性结节;仅RSV+CpG in.组小鼠可见肺组织炎性结节（83.3%）;2、RSV+CpG ip.组及RSV+CpG in.组出现明显的肺组织病理损伤,但仅RSV+CpG in.组形成炎症细胞结节;RSV+CpG ip.组较RSV组有炎症病理评分升高的趋势;RSV+CpG in.组细支气管周围炎症（P<0.001）、肺小血管周围炎症（P<0.05）、肺间质炎症（P<0.0001）及总体肺组织炎症（P<0.05）高于RSV组及RSV+CpG ip.组;RSV组（P<0.01）、RSV+CpG ip.组（P<0.0001）BALF中炎症细胞总计数较对照组增加,其中以巨噬细胞最为明显（P<0.05）;RSV+CpG ip.组较RSV组炎症细胞总计数（P<0.0001）及巨噬细胞计数（P<0.001）均进一步升高;RSV组（P<0.05）、RSV+CpG ip.组（P<0.0001）及RSV+CpG in.组（P<0.01）气道阻力均较对照组显著升高;而RSV+CpG ip.组（P<0.05）及RSV+CpG in.组（P<0.01）气道阻力均较RSV组进一步升高,且RSV+CpG in.组开始出现气道阻力增加的乙酰胆碱溶液浓度更低（3.125mg/ml）;3、HE染色示RSV+CpG组小气道的炎性结节中心浸润有大量炎症细胞,细胞呈圆形,细胞核分叶,呈粒细胞样;流式细胞检测RSV+CpG组小鼠肺组织中中性粒细胞百分比显著高于对照组（P<0.05）、CpG组（P<0.05）及RSV组（P<0.01）;RSV+CpG组小鼠肺组织T淋巴细胞百分比与各组相比并无变化;虽然RSV+CpG组小鼠肺组织B淋巴细胞百分比较对照组有轻度升高、NK细胞较对照组有减低,但与RSV组相比较均没有统计学差异;透射电镜下观察到肺组织中有大量中性粒细胞浸润;4、RSV+CpG炎性结节部位细胞间隙有少量粘液分布,炎性结节周围泡沫样细胞中分布有大量的脂质;5、HE染色示RSV+CpG组炎性结节周围分布有大量泡沫样细胞,细胞呈圆形,体积增大,细胞核居中或偏心,胞质淡染;免疫荧光染色巨噬细胞（CD68+）增多,分布位置与HE染色中泡沫样细胞分布位置一致,RSV+CpG组CD68荧光强度显著高于对照组（P<0.0001）、CpG组（P<0.0001）及RSV组（P<0.0001）;RSV+CpG组CD68平均荧光强度亦显著高于对照组（P<0.01）、CpG组（P<0.0001）及RSV组（P<0.0001）;流式细胞检测RSV+CpG组小鼠肺组织中巨噬细胞百分比显著高于对照组（P<0.05）、CpG组（P<0.05）及RSV组（P<0.01）,然而RSV+CpG组间质巨噬细胞百分比并未升高;6、免疫荧光染色ATⅡs（SPC+）增多,RSV+CpG组SPC荧光强度显著高于对照组（P<0.001）、CpG组（P<0.01）及RSV组（P<0.01）;RSV+CpG组SPC平均荧光强度亦显著高于对照组（P<0.0001）、CpG组（P<0.0001）及RSV组（P<0.0001）;流式细胞检测RSV+CpG组小鼠肺组织中ATⅡs百分比显著高于对照组（P<0.05）、CpG组（P<0.01）及RSV组（P<0.05）;7、透射电镜下观察ATⅡs形态,RSV+CpG组小鼠ATⅡs板层小体较RSV组显著活化,板层小体体积变大,数量增多,分布密度显著增加。结论:RSV感染后期CpG ODN局部刺激或全身给药均可加重气道炎症、AHR,在RSV+CpG in.组小鼠肺组织炎症、AHR加重最为明显,且伴有肺组织炎性结节形成。炎性结节病灶中心大量聚集的炎症细胞以中性粒细胞为主,外周存在脂质堆积及泡沫样细胞形成;ATⅡs数量增多及功能异常可能参与了炎性结节的形成过程。