第一部分支气管肺发育不良患儿的肠道菌群组成目的:支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早产儿最常见的并发症之一。随着围产医疗和新生儿重症监护室（Neonatal intensive care unit,NICU）技术迅速发展,超/极早早产儿和超/极低出生体重儿存活率明显提高,导致BPD发病率也逐渐增高。近些年,越来越多的证据表明肠道菌群与肺部疾病的密切关联。因此本部分研究从肠道菌群入手,通过收集BPD组和对照组患儿出生后第7天和第28天的粪便样本,使用16S rDNA测序技术对早产儿肠道菌群进行分析研究,探讨早产儿中BPD和对照组肠道菌群变化,为BPD的防治提供临床数据。方法:（1）纳入标准:出生后24小时内收治于重庆医科大学附属儿童医院新生儿诊治中心出生体重<1500g、胎龄<32周并且需予以机械通气（无创或者有创）的早产儿。纳入研究需征得患儿家属知情同意。（2）排除标准:1)复杂型先天性心脏病;2)中枢神经系统畸形;3)呼吸系统畸形;4)消化道畸形（肛门闭锁、先天性巨结肠）、坏死性小肠结肠炎;5)其他畸形:膈疝、染色体异常等;6)家属不愿意参加。BPD的诊断采用2001年美国国立儿童健康与人类发育研究所（National Institute of Child Health and Human Development,NICHD）通过的关于BPD的诊断标准。研究分组:按照BPD的诊断标准,把最后发展为BPD的早产儿纳入BPD组。对照组为同期住院的非BPD早产儿,依据分娩方式、喂养方式、产前产后是否使用抗生素等基本情况与BPD组按照1:1相匹配。使用16S rDNA测序技术分析两组研究对象肠道菌群的组成变化情况。结果:一:临床信息:本研究共纳入研究对象16例,对照组和BPD组各8例。BPD组和对照组患儿均为入住重庆医科大学附属儿童医院新生儿中心NICU的早产儿,两组研究对象在出生体重、胎龄、性别比例、出生方式、喂养方式、有无败血症、有无新生儿呼吸窘迫综合征、有无妊娠期高血压、产前抗生素使用、产后抗生素使用天数等方面均无差异（p>0.05）。二:样本高通量测序结果:（1）菌群多样性分析:第7天时,BPD组多样性指数较对照组高（p<0.05）。第28天时,对照组多样性指数较BPD组高,差异没有统计学意义。从第7天到第28天,对照组的多样性指数明显升高（p<0.01）,BPD组的多样性指数增加的差异没有统计学意义。（2）菌群构成:在门水平,第7天时,两组中均是厚壁菌门和变形菌门占主要,BPD组还有较少的放线菌门。BPD组厚壁菌门丰度较对照组低（p<0.05）,而变形菌门和放线菌门（p<0.05）丰度较对照组高;在第28天时,两组仍然以厚壁菌门和变形菌门为主,BPD组变形菌门较对照组高,而厚壁菌门和拟杆菌门较对照组低,但是差异没有统计学意义。从第7天到28天,对照组厚壁菌门相对丰度降低（p<0.05）,变形菌门相对丰度增加（p<0.05）。在BPD组,随着时间变化,厚壁菌门和放线菌门丰度降低,而变形菌门丰度增加,但是差异没有统计学意义。总之,在7天和28天,BPD组变形菌门丰度始终高于对照组,厚壁菌门丰度始终低于对照组。放线菌门丰度在第7天时,BPD组高于对照组。在属水平上,第7天时,BPD组菌属丰度前六分别是:肠球菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、链球菌属、乳杆菌、狭义梭菌属。对照组菌属丰度前六分别是:梭菌、肠球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌、链球菌属、狭义梭菌属。其中BPD组克雷伯氏菌属（p<0.05）、韦荣氏球菌属（p<0.05）丰度均高于对照组。第28天BPD组菌属相对丰度前六分别是:韦荣氏球菌属、狭义梭菌属、克雷伯氏菌属、梭菌、不动杆菌属、Escherichia-Shigella。对照组菌属丰度前六分别是:狭义梭菌属、肠球菌属、Lachnoclostridium、链球菌属、克雷伯菌属、拟杆菌属。两组之间具有统计学差异的菌属为Escherichia-Shigella（p<0.05）,BPD组Escherichia-Shigella丰度较对照组高。BPD组第28天克雷伯氏菌属（p<0.05）、肠杆菌（p<0.05）丰度高于第7天。在对照组,第28天狭义梭菌属（p<0.05）和Lachnoclostridium（p<0.05）丰度高于第7天,葡萄球菌属（p<0.05）丰度明显低于第7天。结论:第一部分使用16S rDNA测序技术对BPD组和对照组早产儿肠道菌群进行了分析。结果显示,在BPD发生前,肠道菌群多样性已经发生了变化,并且机会致病菌较对照组增加。结果提示应该尽早关注早产儿肠道菌群变化,及时发现BPD易感性高的早产儿。同时需要进一步多中心的大样本临床研究来提供更为充分的数据。第二部分乙酸在支气管肺发育不良中的作用研究目的:BPD是早产儿常见的肺部并发症。短链脂肪酸是肠道菌群产生的代谢产物,其抗炎功能众所周知。短链脂肪酸在BPD中的作用尚未研究。因此,我们通过检测BPD小鼠肠道菌群和血清中短链脂肪酸水平,再予以相应的实验干预BPD小鼠,研究短链脂肪酸对BPD小鼠肺部炎症和肺损伤的影响。方法:1.收集BPD和对照组小鼠粪便和血清。使用高效液相色谱法测定各组小鼠血清短链脂肪酸的水平,并使用16S rDNA高通量测序研究分析各组小鼠肠道菌群。2.动物实验:C57BL/6小鼠在出生后第3天随机分为三组:空气对照组、高氧BPD组和高氧+乙酸（250m M,0.02ml/g）组。使用高效液相色谱法测定三组小鼠血清短链脂肪酸的水平,并使用16S rDNA高通量测序研究分析三组小鼠肠道菌群。使用HE染色和免疫组化评估三组小鼠肺部损伤和炎症情况。ELISA和RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-18的表达,Western blot检测NLRP3和caspase-1的表达。3.细胞实验:用LPS和ATP建立分泌NLRP3炎症小体的人肺腺癌细胞（A549细胞）模型,然后用乙酸和GPR43拮抗剂干预细胞。RT-PCR检测炎症因子IL-1β和IL-18的表达,Western blot检测NLRP3和caspase-1的表达。结果:1.与空气对照组小鼠相比,BPD小鼠肠道变形菌门（p<0.001）相对丰度增加,而拟杆菌门相对丰度（p<0.05）降低,并且BPD小鼠血清中乙酸水平也显著降低（p<0.05）。2.与空气对照组相比,BPD小鼠存活率降低,肺损伤严重（RAC p<0.001;MLI p<0.001）,肺内巨噬细胞聚集较多（p<0.001）。RT-PCR和ELISA均提示IL-1β、IL-18、TNF-α（p值均<0.001）表达增加,RT-PCR检测GPR43表达降低（p<0.001）,Western blot检测NLRP3和Caspase-1表达增加（p值均<0.01）。乙酸处理BPD小鼠后,BPD小鼠肺损伤减轻（RAC p<0.001;MLI p<0.001）,肺内巨噬细胞聚集减少（p<0.05）,肺组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18表达降低（p值均<0.001）,NLRP3和caspase-1的表达也降低（p值均<0.05）,而GPR43的表达则增加（p<0.001）。并且乙酸干预之后,BPD小鼠中变形菌门的丰度显著降低,拟杆菌门相对丰度显著增加。3.在A549细胞中发现,不同浓度乙酸干预A549细胞之后,可以明显降低LPS和ATP引起的细胞炎症。在m RNA水平,与LA组相比,5A-LA组和10A-LA组,IL-1β和IL-18的表达均降低（5A-LA:IL-1βp<0.05 IL-18 p<0.01;10A-LA:IL-1βp<0.001 IL-18 p<0.001）。在蛋白水平,与LA组相比,5A-LA组和10A-LA组Caspase-1和NLRP3的表达也降低（5A-LA:NLRP3 p<0.05 Caspase-1 p<0.05;10A-LA:NLRP3p<0.01 Caspase-1 p<0.01）。在加入GPR43拮抗剂之后,与10A-LA组相比,IL-1β（p<0.01）、IL-18（p<0.05）、NLRP3（p<0.05）、Caspase-1（p<0.05）在细胞中的表达水平均升高。说明GPR43拮抗剂可以部分逆转乙酸抑制炎症的效果。结论:BPD小鼠和对照组小鼠肠道菌群有明显差异,并且BPD小鼠血清中短链脂肪酸水平降低,尤其是乙酸显著降低,提示乙酸可能在BPD的发生发展中有一定的保护作用。用乙酸干预BPD小鼠之后,发现BPD小鼠肺部损伤减轻,炎症缓解,NLRP3炎症小体相关蛋白表达降低,并且可以调节BPD的肠道菌群的变化。而且体内实验进一步验证了乙酸通过激活GPR43的表达发挥了抑制NLRP3炎症小体的作用。因此,乙酸作为肠道菌群重要的代谢产物之一,通过调节肠道菌群和抑制NLRP3相关蛋白的表达,在BPD的疾病进展中发挥了保护作用。