细菌耐药问题是目前全球面对的最严重的公共卫生问题之一,其中革兰氏阴性菌耐药问题尤为严重。外膜是革兰氏阴性菌特有的结构,也是细菌固有耐药的重要原因。外膜蛋白（Outermembrane proteins,OMPs）是外膜上的一类重要的蛋白,对于外膜的形成和稳定起到关键的作用。OMPs在外膜上大多以β-桶状折叠结构存在,这种折叠结构是其功能正常发挥的基础。OMPs在细胞质中合成后,通过多个因子的作用转运至外膜,在β-状蛋白折叠组装辅助因子（β-barrel assembly machine,BAM）复合体的辅助下进行折叠,并组装在外膜中。BAM复合体包括BamA-BamE五种蛋白,其中BamA和BamD是关键蛋白,它们功能受损会导致OMPs折叠受阻和外膜缺损,并且导致未折叠的外膜蛋白在周质空间中堆积,造成菌体毒性而导致菌体死亡。BamA是OMPs在外膜上折叠和装配的主要场所,BamD能够识别并接收未折叠的OMPs（uOMPs）,并通过与BamA之间的相互作用将其传递给BamA,与其他三个Bam蛋白一起协调BamA的构象变化,共同完成外膜蛋白的折叠组装。鉴于BamA和BamD在OMPs生物合成和菌体生存中的重要作用,其作为抗革兰氏阴性菌药物靶标受到越来越多的关注,而目前尚未有BamA和BamD蛋白相互作用抑制剂的相关报道,因此以其为靶点可能发现全新机制的抗革兰氏阴性菌药物先导化合物。本实验室在前期工作中构建了大肠杆菌BamA/BamD蛋白相互作用酵母双杂交模型,本研究在此基础上对模型进行了验证,并建立了基于缺陷培养基生长原理的96孔板高通量筛选方法,联合应用大肠杆菌表型筛选,对本室化合物库中的10万余个化合物进行了筛选,最终得到阳性化合物IMB-H4。并在模型水平、分子水平和细胞水平上进一步确认了化合物IMB-H4对BamA/BamD蛋白相互作用的阻断。首先在酵母双杂交系统中通过β-半乳糖苷酶定量方法发现IMB-H4作用下模型菌β-半乳糖苷酶活性明显降低,并具有浓度依赖性;然后通过GST pull-down在分子水平上检测到IMB-H4对BamA/BamD蛋白相互作用的阻断,BLI技术检测到IMB-H4与BamA蛋白的结合。在细胞水平上,透射电镜结果显示IMB-H4作用下外膜明显破损,EtBr摄入量呈现剂量依赖性增加佐证了外膜的破损;扫描电镜下可见IMB-H4作用后菌体表面出现纽扣状结构;Western-blot分析发现IMB-H4处理菌的OmpA和OmpC在外膜上的分布呈现剂量依赖性减少,这些结果证明了 IMB-H4能够在菌体内阻断BamA/BamD蛋白相互作用。IMB-H4表现出较好的抗大肠杆菌活性,对E.coli ATCC 25922的MIC为4μg/mL,对多株大肠杆菌临床耐药株具有一定的抑制活性,MIC为4～32 μg/mL;IMB-H4低浓度下呈现抑菌活性,在高浓度时呈现杀菌活性。BamA的过表达能够明显拮抗IMB-H4的抗菌活性,与空载体对照和BamD过表达株相比MIC上调4倍。IMB-H4是5-硝基呋喃衍生物,而三个5-硝基呋喃衍生物呋喃唑酮（FZ）、呋喃西林（NFZ）和呋喃妥因（NIT）对 AH109（pAD-BamA+pBD-BamD）和 AH109（pAD-T+pBD-53）菌株的MIC无显著差异,表明IMB-H4与其他硝基呋喃类化合物抗菌作用机制有所区别,其抗菌活性与BamA/BamD蛋白相互作用相关。IMB-H4对哺乳动物细胞毒性较低,对HeLa细胞的IC50为76.5 μg/mL。BamA本身也是外膜蛋白,BamD能够识别并结合未折叠BamA蛋白C-末端的β-信号肽序列,将其定位到外膜完成折叠;而折叠的BamA蛋白通过周质空间的N-末端与BamD蛋白结合,完成其他OMPs的传递和折叠。为了进一步确定IMB-H4阻断的是哪种状态的BamA与BamD蛋白的相互作用,我们通过Semi-SDS-PAGE对酵母双杂交模型中表达的BamA蛋白和纯化的BamA蛋白折叠状态进行了检测,结果发现两种BamA蛋白均是未折叠状态,IMB-H4阻断的是未折叠的BamA蛋白与BamD蛋白之间的相互作用。综上所述,本研究在酵母双杂交系统中验证了大肠杆菌BamA与BamD蛋白的相互作用,并且建立了 BamA/BamD蛋白相互作用抑制剂的高通量筛选方法,通过筛选获得具有抗大肠杆菌活性的阳性化合物IMB-H4,该化合物的抗菌活性与BamA/BamD蛋白相互作用阻断相关。该研究是首次以BAM复合体为靶标进行抗革兰氏阴性菌药物筛选,为寻找以破坏外膜为靶标的新型抗革兰氏阴性菌抗生素提供了新的思路。