目的:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是临床发病率和死亡率占首位的消化道恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康。虽然针对结直肠癌化疗的传统化疗方案的临床疗效被普遍认可,但治疗过程中多药耐药现象（Multiresistance,MDR）的出现一直是阻碍临床患者治疗获益的瓶颈问题。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）起初被认为是人类基因组中无功能的“暗物质”,近几年lnc RNA通过转录及转录后表观修饰介导肿瘤耐药特性的研究越来越受到学者们的关注。端粒酶RNA组分（Telomerase RNA Component,TERC）是一条451nt长的lnc RNA,其在多种肿瘤中均发挥不可小觑的功能,提示阐明TERC在癌症中扮演的关键角色对精准诊疗有着十分重要的影响。目前,仅有研究报道TERC基因多态性与端粒延长和CRC风险增加相关,而其在结直肠癌发生发展及耐药中的生物学特性及作用机制亟待阐明。另一方面,频发的基因pre-m RNA可变剪接（Alternative splicing,AS）事件是精密调控基因表达和蛋白质多样性的重要分子基础。大量证据表明AS异常介导表达失衡的剪接异构体在调控肿瘤进展及耐药形成过程中发挥着不同甚至截然相反的功能。ATP结合盒亚家族A成员8（ATP Binding Cassette Transporter A8,ABCA8）原本以转运脂质和胆固醇为特征,最近报道发现其在多种癌症中发挥调控肿瘤进程的关键作用。课题组最近关注AS事件分布规律发现CRC细胞中存在全长型ABCA8（ABCA8-L）和截短型ABCA8（ABCA8-S）两种转录本。然而,目前尚未见ABCA8-AS调控在肿瘤中的相关报道,其在CRC发生发展及耐药中的作用模式和具体机制也不清楚。剪接蛋白在调控靶基因AS中,既能特异识别pre-m RNA,又能被上游调控因子招募或稳定,凭借着其精准调控AS模式的“开-关”作用,已成为表观修饰领域备受关注的明星分子。其中,RNA结合蛋白10（RNA-binding protein 10,RBM10）已经被证实通过结合与剪接位点相邻的侧翼内含子区域（包括其自身的pre-m RNA中的位点）来抑制外显子包含。然而,关于RBM10调控更多靶基因pre-m RNA发生AS的相关机制的研究还不够透彻。本研究旨在阐明CRC奥沙利铂耐药细胞中TERC通过RBM10介导ABCA8-AS事件的调控方式与作用机制,为预测CRC奥沙利铂化疗耐药筛选潜在的生物标志物,为逆转CRC药物抵抗提供新的治疗策略。研究目的具体分为以下三个部分。第一部分:明确TERC异常上调介导ABCA8可变剪接与CRC奥沙利铂耐药相关。第二部分:阐明CRC中TERC稳定RBM10触发ABCA8外显子15跳跃型剪接的作用方式和关键位点。第三部分:体内和体外验证TERC/RBM10/ABCA8-AS作用轴在CRC奥沙利铂耐药形成中的作用。方法:1.生物信息学分析和网络在线平台应用1.1基于CRC芯片表达谱数据聚类分析筛选出显著差异表达的TERC。1.2采用KEGG分析富集出TERC共表达m RNA的作用通路。1.3绘制韦恩图交集出TERC介导的与耐药相关且发生AS的关键下游ABCA8。1.4使用3d RNA网络在线平台预测TERC和ABCA8 pre-m RNA（外显子14-16）的三级结构。1.5通过PDB网站下载RBM10的RRM2和OCRE结构域的3D晶体结构。1.6借助MOE平台3D对接出TERC和ABCA8 pre-m RNA（外显子14-16）与RBM10蛋白结合的空间构象和结合位点。2.CRC组织样本相关实验2.1收集4对CRC样本经RNA-seq技术得到“lnc RNA-m RNA-AS”芯片表达谱。2.2纳入大样本成对CRC组织样本（n=149）,制作组织微阵列（TMA）芯片,整理患者病理信息,定期随访预后情况。2.3采用组织原位杂交（ISH）分别检测TERC及ABCA8-L/-S（设计特异区别探针）的RNA表达情况。2.4免疫组化法（IHC）检测CRC组织中RBM10表达情况。3.基于CRC细胞的基础表型实验3.1本研究中涉及的主要细胞模型是CRC敏感细胞（HCT116/S和SW480/S）和奥沙利铂耐药细胞（HCT116/R和SW480/R）。3.2采用q-PCR和/或RT-PCR检测并比较不同处理组中的不同指标RNA变化。3.3完成蛋白免疫印迹（WB）和免疫荧光（IF）等实验检测并比较RBM10或ABCA8-L/-S异构体的蛋白表达变化。3.4细胞周期和细胞凋亡等方法比较不同处理组CRC细胞的表型变化。3.5 MTT法检测并分析各处理组不同浓度奥沙利铂处理后CRC细胞IC50变化。3.6通过彗星实验检测不同分组的CRC细胞经奥沙利铂处理后DNA损伤程度。4.分子间互作的机制验证实验4.1原位杂交与免疫荧光结合法检测各候选因子在CRC细胞中的表达共定位。4.2在CRC细胞中完成RIP实验验证TERC与RBM10可以形成互作复合体。4.3基于CRC细胞的蛋白裂解物以及外源性RBM10纯化蛋白进行RNA pull-down实验验证TERC以及ABCA8 pre-m RNA外显子15通过特异序列与RBM10存在直接结合。4.4设计ABCA8 pre-m RNA外显子15相关的野生型WT和截短型ESE-del过表达质粒,将其分别与RBM10共表达至CRC细胞中,q-PCR检测CRC细胞中的ABCA8-L/-S的表达比率变化。5.荷瘤鼠在体验证实验5.1完成腋下荷瘤鼠实验（n=6）,通过不同时间点测量瘤体的长径和短径计算并绘制裸鼠瘤体体积生长曲线、通过活体小动物成像法观测瘤体形态变化。5.2荷瘤40天后取出瘤体比较瘤体大小、称量瘤体重量、IHC和q-PCR法检测不同处理组的各指标变化。5.3完成腋下荷瘤鼠实验（n=6）,记录裸鼠生存情况至第60天,绘制裸鼠K-M生存曲线。5.4完成尾静脉荷瘤鼠实验（n=6）,活体小动物成像法检测并比较各处理组的裸鼠尾静脉注射癌细胞的肺转移情况。5.5荷瘤60天后取出肺部转移瘤体,IHC法检测不同处理组的各指标变化。6.统计与分析6.1对于原位杂交和免疫组化结果,显微镜下统计表达评分后,使用WPS office2019套件中的EXCEL建立表格录入统计的表达量,使用统计软件SPSS26.0或Graph Pad Prism 8.0.1统计分析。具体来说,线性回归分析TERC、RBM10蛋白及ABCA8-L/-S之间表达的相关性;绘制ROC曲线判定以上各指标的高/低表达的最佳Cutoff值;进一步应用皮尔逊卡方检验、非条件logistic回归分析候选因子高低表达与临床病理参数的相关性;应用Log-rank单因素K-M法和校正多因素COX回归分别分析TERC、RBM10蛋白及ABCA8-L/-S高低表达与CRC患者预后的相关性。6.2本实验其他数据均采用Graph Pad Prism 8.0.1或WPS office 2019套件中的EXCEL统计并绘制折线图、柱状图等具体的统计用Student’T检验比较各组间的差异,并以平均值±标准偏差（±SD）表示,P＜0.05视为差异有统计学意义。结果:1.TERC异常上调介导ABCA8可变剪接与CRC奥沙利铂耐药相关1.1 CRC组织和细胞中TERC高表达与奥沙利铂耐药相关:首先,基于4对CRC芯片表达谱发现TERC在CRC组织中显著高表达（FC=3.17）。随后,检测成对大样本CRC组织样本（n=149）发现TERC在CRC组织中的异常高表达与肿瘤占肠周＞1/2,肿瘤直径＞6cm和发生转移密切相关。此外,TERC高表达的患者接受奥沙利铂化疗后生存时间明显缩短。对比CRC敏感细胞,TERC在CRC奥沙利铂耐药细胞中确为高表达。1.2 TERC促进CRC耐药与ABCA8-L/-S异构体失衡相关:TERC共表达m RNA主要富集在“可变剪接体”和耐药相关的“ABC转运蛋白”通路上,韦恩图交集多药耐药、发生AS以及显著下调的基因得到关键下游ABCA8。其中,ABCA8 pre-m RNA外显子15跳跃型剪接评分最高,生成新的ABCA8-S异构体。基于特制探针检测成对大样本CRC组织样本（n=149）发现ABCA8-L在CRC组织中的低表达与TERC负相关,而ABCA8-S高表达与TERC正相关。ABCA8-S高表达与CRC进展及接受奥沙利铂化疗患者不良预后相关,而ABCA8-L相反。此外,CRC奥沙利铂耐药细胞中的ABCA8-L水平显著降低,而ABCA8-S显著升高,且随着TERC的减少,ABCA8-S表达比例逐渐增加。1.3 TERC调控ABCA8-L/-S异构体表达并诱导CRC耐药:过表达TERC后,在CRC细胞中ABCA8-S表达量显著升高、ABCA8-L显著降低,反之亦然。TERC表达上调后,奥沙利铂处理诱发的CRC细胞周期阻滞和凋亡显著减弱,反之亦然。TERC过表达显著减弱奥沙利铂对CRC细胞的杀伤效应和DNA损伤程度。2.TERC稳定RBM10触发ABCA8外显子15跳跃剪接的作用方式和关键位点2.1可变剪接蛋白RBM10是TERC介导ABCA8-AS事件的关键因子:基于CRC细胞裂解物,将TERC探针拖拽到的蛋白送质谱检测后得到RBM10蛋白。RBM10在CRC组织（n=149）中异常高表达与TERC和ABCA8-S显著正相关,而与ABCA8-L负相关。此外,RBM10高表达与CRC进展和接受奥沙利铂化疗的患者（n=86）预后不良密切相关。最后,WB法明确RBM10蛋白在CRC奥沙利铂耐药细胞株中确为高表达,且过表达TERC后沉默RBM10时ABCA8-L/-S异构体表达得到恢复。2.2 TERC通过特异序列稳定可变剪接蛋白RBM10的机制验证:TERC过表达显著升高CRC细胞中RBM10的水平,反之亦然。沉默TERC后RBM10蛋白稳定性显著降低,且TERC与RBM10在细胞核表达存在高度共定位。RIP实验表明RBM10抗体可以明显拖拽到TERC,当TERC过表达时,TERC丰度显著增加（P＜0.05）。预测TERC通过GGGCCC（-249～-243）序列与RBM10-OCRE互作后,RNA pull-down实验发现:相较于TERC-Mut,TERC-WT可以显著富集CRC细胞中的RBM10蛋白,且其丰度在沉默TERC后显著降低。2.3 RBM10识别ESE元件促进ABCA8 pre-m RNA外显子15跳跃剪接的机制验证:沉默RBM10表达后,ABCA8-S的m RNA和蛋白表达下调,ABCA8-L相反,且RBM10与ABCA8 pre-m RNA在细胞核表达存在高度共定位。预测发现UUCA是RBM10-RRM2识别ABCA8 pre-m RNA外显子15的关键序列后,RNA pull-down实验发现,相较于pre-A8-Mut,pre-A8-WT可以显著富集CRC细胞中的RBM10蛋白,且其丰度在沉默TERC后显著降低。构建ABCA8 pre-m RNA野生型和ESE元件敲减型质粒,与RBM10共表达可以显著提高pre-A8-WT序列剪接得到的ABCA8-S亚型表达百分比,而在pre-A8-Mut序列无此改变。3.体内和体外验证TERC/RBM10/ABCA8-AS作用轴在CRC奥沙利铂耐药形成中的作用。3.1 RBM10通过关键位点参与TERC/ABCA8-AS轴促进CRC细胞奥沙利铂耐药:设计RBM10-OCRE与TERC结合位点（Thr571和Gln583）突变的质粒R10-Mut1及RBM10-RRM2与ABCA8 pre-m RNA结合位点（Lys400和Lys402）突变的质粒R10-Mut2,CRC奥沙利铂耐药细胞中沉默TERC后过表达R10-WT可以显著恢复ABCA8-L/-S的m RNA和蛋白表达,而R10-Mut1和R10-Mut2无此作用。此外,CRC奥沙利铂耐药细胞中沉默TERC后过表达R10-WT可以显著恢复细胞增殖、凋亡、IC50及DNA损伤水平,而R10-Mut1和R10-Mut2无此作用。3.2在体验证TERC/RBM10/ABCA8-AS轴在CRC奥沙利铂耐药中的作用:沉默TERC可以显著增强奥沙利铂对CRC瘤体的增殖速度的抑制作用。此外,沉默TERC可以显著缩短奥沙利铂处理后CRC移植瘤裸鼠的生存时间。荷瘤40天后剖瘤发现瘤体体积和瘤重显著缩小。此外,ABCA8-S可以恢复沉默TERC导致的药物敏感作用,而ABCA8-L无此效应。进一步检测原位瘤体及肺转移瘤体中各指标发现,TERC沉默可以抑制CRC瘤体中的RBM10蛋白表达,并且下调ABCA8-S的表达比例。结论:1.CRC组织和细胞中TERC表达上调介导ABCA8-L/-S剪接异构体表达失衡并促进奥沙利铂耐药形成。2.RBM10作为中间环节,其被TERC通过关键序列GGGCCC（-249～-243）直接结合并稳定后,通过特异识别ABCA8 pre-m RNA外显子15-ESE元件UUCA（+38～+41）促进外显子跳跃型剪接。3.TERC依赖RBM10关键位点（OCRE:Thr571和Gln583）和（RRM2:Lys400和Lys402）增加ABCA8-S异构体表达比例促进CRC细胞奥沙利铂抵抗,最终阐明“TERC/ABCA8-AS/CRC耐药”作用轴。