目的:Reprimo(RPRM)是从接受X射线照射的具有野生型p53的小鼠胚胎成纤维细胞中首次分离发现的,是一个DNA损伤诱导激活的基因。RPRM自发现以来一直被认为是抑癌基因。研究发现RPRM在包括胃癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中因其启动子高度甲基化而导致其在这些肿瘤中低表达甚至缺失。而RPRM低表达可以促进肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移,影响肿瘤的转归和预后。另一方面,肿瘤细胞高表达RPRM后可诱发细胞周期G2/M期阻滞、细胞增殖和迁移减慢、细胞凋亡增加等一系列应答反应。这些结果提示RPRM在肿瘤的发生、进展和治疗中可能具有重要作用。然而截止目前为止,对这个基因的研究还非常有限。RPRM调控细胞和组织的动态平衡包括生长、迁移、细胞存活等的信号通路以及肿瘤细胞RPRM发生DNA甲基化的具体机制并不清楚。近年来研究发现表观修饰的失调诸如DNA异常甲基化与肿瘤的放射敏感性降低有关。那么,RPRM在肿瘤细胞中的高度甲基化是否会影响肿瘤细胞的放射敏感性呢?RPRM既然可受DNA损伤诱导激活,又参与调控细胞生长和凋亡,那么它是否在DNA损伤修复应答中发挥功能?这些问题同样未知。因此,开展对RPRM功能的研究对于理解细胞多种生命活动的调控机理和肿瘤的发生机制具有重要理论意义。并且,明确RPRM是否影响肿瘤细胞的放射敏感性,是否参与DNA损伤修复应答过程等问题对于阐明肿瘤放射抵抗机制,为临床肿瘤放疗辅助增敏寻找新的靶点,以及进一步探索DNA损伤修复应答机制具有重要的理论和实践意义。方法:本研究以非小细胞肺癌细胞为研究载体对RPRM的功能进行探究。本研究第一部分首先通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测了 RPRM在三株不同的非小细胞肺癌细胞系即H460、A549和H1299细胞中的表达情况。之后通过质粒转染和慢病毒感染的方式分别构建了高表达RPRM和RPRM敲低的稳转株。在探究RPRM对细胞放射敏感性的影响作用中采用克隆形成实验和微核形成实验。本研究第二部分在对RPRM影响肿瘤细胞放射敏感性机制的探究中,首先通过彗星实验检测RPRM对辐照诱导DNA损伤的影响。随后采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测辐照后高表达RPRM组和对照组细胞DNA损伤修复相关蛋白的表达情况,以明确RPRM在DNA损伤修复通路中的作用。在对RPRM调控DNA损伤修复通路的机制研究中,通过免疫荧光、细胞核和细胞质成分分离、免疫共沉淀实验明确RPRM的亚细胞定位及其入核机制;采用蛋白免疫印迹和免疫荧光亚细胞结构荧光强度分析明确了高表达RPRM对于辐照后ATM亚细胞定位改变的影响,在用出核抑制剂Leptomycin B抑制ATM出核后采用细胞核、细胞质ATM荧光强度分析明确RPRM调控ATM亚细胞定位的作用;采用蛋白免疫印迹检测蛋白酶体抑制剂MG132处理组和对照组细胞ATM的表达变化,以明确RPRM促进ATM降解的作用。本研究第三部分通过建立裸鼠皮下移植瘤模型研究体内高表达RPRM对于肿瘤生长和放射敏感性的影响。分别将高表达RPRM和阴性对照的H460细胞以皮下注射的方式接种于裸鼠,待肿瘤体积达到100mm3左右对肿瘤进行局部单次照射。之后连续观察并测量肿瘤体积大小的变化。结果:RPRM在不同的非小细胞肺癌细胞中的表达不尽相同:在含有野生型p53的H460和A549两株细胞中RPRM表达较低,而在p53缺失的H1299细胞中RPRM表达较高。经X射线照射后,RPRM在H460细胞中的激活存在剂量依赖和时间依赖效应。与对照组相比,高表达RPRM的H460和A549细胞在受到X射线照射后克隆形成率显著降低,微核形成率增加,提示肿瘤细胞的放射敏感性增加。另一方面,敲低RPRM的H460细胞受照后克隆形成率高于其相应对照,而微核形成率低于对照。这些结果表明RPRM能增加肿瘤细胞的放射敏感性。进一步研究发现高表达RPRM的H460细胞受照后短时间内DNA损伤更加严重,彗星实验结果表现为DNA拖尾更长且尾矩更大。另一方面,在照射后8小时,对照组细胞损伤的DNA基本被修复,而高表达RPRM的细胞仍残存部分未被修复的DNA损伤,提示RPRM可能抑制了肿瘤细胞的DNA损伤修复能力。为了验证RPRM对DNA损伤修复应答的影响,本研究检测了 DNA损伤修复相关蛋白的激活与表达。结果证实高表达RPRM的细胞的DNA损伤修复核心蛋白ATM的表达量在受照后2小时显著降低,导致其自身磷酸化水平降低,其下游的DNA损伤修复相关蛋白如γ-H2AX、53BP1、RAD51和p53等均受到抑制,从而导致DNA损伤修复通路发生应答缺陷。通过MG132——蛋白酶体抑制剂抑制蛋白降解后,高表达RPRM的肿瘤细胞的ATM表达量明显增加,证实RPRM可通过促进ATM的降解而降低其表达量。在进一步探究RPRM促进ATM降解的机制过程中,本研究首次发现细胞在受到X射线照射后其RPRM在入核转运蛋白IPO-11的介导下会迅速发生由胞质向胞核的转运。并且,RPRM的入核和出核促进了 ATM由胞核向胞质转运继而发生降解,从而干扰ATM在DNA损伤修复应答中发挥重要作用。本研究通过免疫共沉淀实验也证实了 RPRM与ATM之间存在相互作用,为RPRM调控ATM的核转运提供了可靠证据。另一方面,在抑制ATM的出核转运后,细胞的放射敏感性显著降低,也提示促进ATM的出核转运是RPRM增加细胞放射敏感性所必须的。RPRM增加肿瘤细胞的放射敏感性这一现象也在体内实验中也得到证实。与对照组相比,RPRM高表达的肿瘤生长速度变慢、生长受限,并且在照射后RPRM高表达的肿瘤体积缩小幅度更大甚至无肉眼可见包块,这一结果也与细胞实验相互印证。以上结果证明RPRM通过促进ATM的出核转运和降解来干扰DNA损伤修复应答反应,使得损伤的DNA无法被有效修复,从而增加肿瘤细胞的放射敏感性。结论:本研究发现并证实了 RPRM增加非小细胞肺癌细胞放射敏感性的新功能。其中的机制为RPRM在DNA损伤诱导下由入核转运蛋白IPO-11介导发生胞质向胞核的转运,入核的RPRM与ATM发生相互作用并促进ATM向胞质转运,并在胞质发生降解,从而抑制ATM的有效激活,使得其下游DNA损伤修复相关蛋白的激活亦受限,细胞DNA损伤修复能力下降,最终导致肿瘤细胞放射敏感性增加。本研究发现并证实了 RPRM对DNA损伤修复通路中的核心蛋白ATM具有重要调控作用。为临床肺癌放射辅助治疗和预后转归提供了新的靶点和重要参考依据。