肝癌是一种侵袭性较强且预后较差的恶性肿瘤。全球大约75%的肝癌发生在亚洲,中国的肝癌患者人数占全球病人总数的一半。因此,中国的肝癌防治任重道远且亟待加强。既往的研究发现某些肝脏的干性标志物可以用于分离具有干细胞特性的肝癌细胞,这些细胞被称为肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞。肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发,转移以及化疗耐药的主要原因。尽管肿瘤干细胞假说已经得到了实验证实,但是目前临床上缺少有效的治疗策略来限制它们的生物学活动进而抑制肿瘤进展。能量代谢是一切生命活动的基础,近年来肿瘤代谢领域的研究已经成为肿瘤研究的热点。相关研究表明,肿瘤干细胞在发生发展过程中会不断对营养物质的摄取以及代谢方式进行重编程以满足不同的生物能,生物合成和氧化还原反应的需求。代谢重编程已成为癌症的标志性特点之一。广泛的实验研究表明肿瘤干细胞倾向于通过线粒体的呼吸作用来满足自身的能量需求。与肿瘤干细胞不同,大量的非肿瘤干细胞主要依赖糖酵解产生能量,这个现象被称为Warburg效应。因此,在肿瘤干细胞分化的过程中必然伴随能量代谢方式的转变。代谢重编程赋予肿瘤细胞调整代谢方式来适应多变的,异质性的生物学进程。然而,肝癌分化过程中的代谢重编程是如何进行及其对预后判断及临床工作的指导意义还不清楚。基于上述对肝癌研究的基本判断,本课题决定运用分子流行病学的思想,找到肝癌干细胞代谢重编程的关键分子,并在大规模的临床样本和数据库中对其作用进行双向验证,为肝癌的临床诊治提供新的靶点和策略。课题组之前的研究表明肝癌干细胞高表达SIRT1。既往的研究证明SIRT1作为重要的去乙酰化酶参与到多种代谢通路中,但是在肝癌代谢中的具体作用还有待进一步的研究。线粒体核糖体一直被认为是线粒体中负责蛋白质合成的细胞器。随着过去几十年研究的深入,人们逐渐发现了线粒体核糖体蛋白在凋亡信号,抗衰老以及调控细胞增殖等方面的新功能。由于线粒体是细胞内能量代谢的核心细胞器,那么线粒体核糖体蛋白是否还独立的参与了肿瘤细胞的代谢过程目前还不清楚。所以我们认为深入研究上述问题有助于全面的理解肝癌细胞的代谢并且为临床治疗提供有价值的潜在新靶点。通过前期实验和TCGA和KEGG数据库的筛选,我们发现线粒体核糖体蛋白S5（MRPS5）可能在肝癌代谢过程中发挥了重要的作用。为了确定MRPS5在肝癌干细胞代谢重编程中的作用,我们将本研究分成了5个部分。首先我们通过Seahorse能量代谢仪检测细胞耗氧率（OCR）,检测细胞内活性氧（ROS）水平和乳酸水平以及线粒体动力学检测等方法发现肝癌干细胞主要依赖氧化磷酸化供能而非干细胞主要进行糖酵解供能。然后我们在细胞和小鼠移植瘤模型中施加线粒体复合物I特异性抑制剂二甲双胍处理后发现线粒体复合物I功能与肝癌干细胞干性之间密切相关,进一步的,我们运用生物信息学方法在TCGA数据库中分析所有线粒体核糖体编码基因与Nduf基因表达的相关性并筛选出与线粒体复合物I功能高度相关的线粒体核糖体蛋白。最后利用TCGA和KEGG数据库对不同的线粒体核糖体蛋白（MRPs）分别进行氧化磷酸化,丙酮酸代谢和三羧酸循环（TCA）的基因集变异分析（GSVA）,明确MRPs与不同代谢过程的相关性。我们发现MRPS5与线粒体复合物I功能及细胞的氧化磷酸化功能高度相关,且作用相对单一较少参与到除氧化呼吸之外的其他代谢过程。第二部分,我们首先敲降MRPS5和外源补充NAD⁺前体物质（NAM）的方式研究细胞内NAD⁺水平与MRPS5的关系,发现敲降MRPS5能够使细胞内的NAD⁺水平显著降低。然后通过Western Blot检测蛋白表达和线粒体形态学的分析发现MRPS5在线粒体生物合成中发挥了重要作用。同时我们用施加双氧水的处理来模拟活性氧蓄积的肿瘤微环境并通过检测HSP60表达来判断线粒体未折叠蛋白反应的强弱,发现MRPS5激活线粒体未折叠蛋白反应而增强肝癌干细胞的抗氧化应激能力。通过上述实验我们发现MRPS5对于增强的肝癌干细胞线粒体功能是必不可少的,并且阐明了具体机制。之后我们敲降MRPS5后检测肝癌干细胞的成球,克隆形成和移植瘤成瘤能力并用极限稀释和原位移植等方式比较敲降MRPS5和正常肝癌干细胞的肿瘤起始能力。我们发现MRPS5在肝癌细胞维持干性过程中发挥了重要的作用。进一步的,我们对临床肿瘤组织样本进行免疫组化分析并对患者信息进行生存分析后发现MRPS5高表达与临床病人预后差相关。第三部分我们首先通过生物信息学预测MRPS5蛋白上的乙酰化修饰位点,然后运用点突变和免疫共沉淀实验明确365号氨基酸是MRPS5的乙酰化修饰位点。接着我们对细胞施加Sirtuin蛋白过表达及特异性抑制剂处理发现SIRT1能显著降低MRPS5的乙酰化水平并通过内源性和外源性两种免疫共沉淀实验证明SIRT1能够与MRPS5发生相互作用。通过以上实验说明MRPS5能够在365号氨基酸发生乙酰化修饰且SIRT1是其特异性的去乙酰化酶。进一步的,我们通过Western-Blot和免疫组化明确MRPS5存在不同的亚细胞定位,然后运用生物信息学预测我们发现MRPS5的蛋白序列中存在细胞核定位序列和线粒体定位序列。之后我们通过Western-Blot,免疫共沉淀及免疫荧光等技术方法证明MRPS5的乙酰化状态决定其亚细胞定位,去乙酰化的MRPS5定位在线粒体上而乙酰化的MRPS5向细胞核聚集。最后我们通过构建线粒体定位序列点突变MRPS5突变体的实验证明只有当MRPS5定位在线粒体上时才能增强线粒体功能。第四部分我们首先通过Seahorse能量代谢仪对细胞的耗氧率和糖酵解水平进行检测发现敲减SIRT1后肝癌干细胞的细胞耗氧率显著降低而糖酵解水平升高。然后我们利用去乙酰化蛋白无法进入细胞核的特点构建MRPS5突变体用以比较入核蛋白作用。通过用Western-Blot和RT-PCR方式检测糖酵解相关蛋白的表达及Seahorse能量代谢检测的方式,我们发现MRPS5进入细胞核后可促进糖酵解相关蛋白的表达并增强细胞的糖酵解功能。最后用二甲双胍干扰线粒体功能后比较不同细胞能量代谢方式的转换情况发现MRPS5增强了肝癌细胞的代谢可塑性。最后在第五部分,我们在临床样本中分析了SIRT1/MRPS5调控轴的实际临床意义并在TCGA数据库中进行了验证。首先对临床病人的肝癌组织样本进行免疫组化分析依据SIRT1表达的高低以及MRPS5的核浆定位分组。然后对分组病人进行临床常用的肝癌干性指标SOX2及EpCAM分析,从结果中我们发现SIRT1^High/Cytoplasmic-MRPS5^High组病人干性标志物的表达更高,说明该组病人肿瘤组织内干细胞比例更高。然后我们在R语言条件下对搜集的临床病理信息进行logistics回归分析发现SIRT1^High/Cytoplasmic-MRPS5^High组病人发生肿瘤体积大,病理分期高,转移,复发,包膜浸润,以及肿瘤癌栓等恶性事件的危险度显著高于SIRT1^Low/Nuclear-MRPS5^High组病人。接着我们对两组病人进行生存分析发现SIRT1^High/Cytoplasmic-MRPS5^High组病人的总体生存时间更短。进一步的,我们将生存情况和病理指标联合起来进行COX回归分析筛选出有价值的危险因素,并通过决策树分析判断不同危险因素在预后判断中的重要程度。从结果中我们发现复发是影响患者总体生存时间最主要的危险因素,而SIRT1-MRPS5轴的表达情况在非复发肝癌病人的预后判断中具有很高的权重,所以可以作为一种新的预后判断指标。为了对结论进行验证,我们利用TCGA数据库中的临床信息重复了上述所有相关分析。在对决策树模型进行分析的过程中我们发现MRPS5的亚细胞定位数据从一个新的维度定义了SIRT1表达量的临界值,从而证实了SIRT1-MRPS5轴与病人临床特征与预后的关系并实现了实际临床数据和生物信息数据库数据对研究结论的双向验证。各部分研究的列表以及主要的结论如下:1.肝癌干细胞主要依赖氧化磷酸化供能及运用生物信息数据库统计筛选研究靶点（1）肝癌干细胞以氧化磷酸化为主要的能量代谢方式;（2）相较于非干细胞,肝癌干细胞的线粒体功能更强;（3）线粒体功能与肝癌干细胞干性密切相关;（4）抑制线粒体复合物I功能减弱肝癌干细胞干性;（5）线粒体核糖体蛋白S5与线粒体复合物I的功能密切相关;（6）线粒体核糖体蛋白S5是MRPs蛋白家族中与细胞氧化磷酸化功能关系最密切的蛋白之一;（7）线粒体核糖体蛋白S5较少参与除氧化磷酸化之外的其他代谢途径。2.MRPS5促进线粒体功能并参与维持肝癌干细胞干性（1）MRPS5通过促进NAD⁺产生增强肝癌干细胞的线粒体呼吸作用;（2）MRPS5在线粒体生物合成过程中发挥重要的作用;（3）MRPS5通过促进NAD⁺的产生而激活线粒体未折叠蛋白反应参与抗氧化进程;（4）MRPS5发挥增强线粒体功能以及维持线粒体健康的双重作用;（5）MRPS5促进肝癌干细胞的自我更新能力;（6）MRPS5增强肝癌干细胞的肿瘤起始能力。3.MRPS5的乙酰化修饰及亚细胞定位（1）MRPS5能够被乙酰化修饰;（2）SIRT1是MRPS5的特异性去乙酰化酶;（3）MRPS5存在细胞浆和细胞核两种亚细胞定位;（4）MRPS5的乙酰化状态决定其亚细胞定位,高度乙酰化的MRPS5向细胞核聚集而去乙酰化的MRPS5由线粒体定位序列引导而定位在线粒体上;（5）只有当MRPS5定位至线粒体时才能增强线粒体功能促进氧化磷酸化。4.MRPS5增强肝癌细胞的代谢可塑性（1）MRPS5进入胞核后促进细胞糖酵解;（2）MRPS5增强了肝癌细胞的代谢可塑性;（3）MRPS5参与了肝癌细胞分化过程中的代谢重编程。5.SIRT1/MRPS5调控轴的临床流行病学研究（1）复发是肝癌病人预后差的最主要危险因素;（2）SIRT1^High/Cytoplasmic-MRPS5^High组的病人更易发生复发,肿瘤进展更快,预后更差;（3）MRPS5的亚细胞定位信息对确定SIRT1表达量的临界值至关重要;（4）干扰SIRT1/MRPS5调控轴介导的代谢重编程有望成为临床治疗的新靶点。综上所述,肝癌干细胞依赖增强的线粒体功能来维持干性,而非干细胞主要通过糖酵解供能进行生命活动。我们发现肝癌干细胞具有更强的氧化磷酸化功能,并且线粒体复合物I在调控线粒体功能及干性维持过程中发挥了重要作用。生物信息学分析发现MRPS5与线粒体复合物I的功能密切相关。进一步的实验证明MRPS5促进了NAD⁺产生,后者是增强线粒体功能的重要代谢产物。MRPS5在维持肝癌干性及促进肿瘤进展中起到了关键作用。机制研究表明,MRPS5的乙酰化状态由NAD⁺依赖的去乙酰化酶SIRT1进行调控,SIRT1在肝癌干细胞中高表达,并随着细胞分化表达量逐渐降低。去乙酰化的MRPS5定位在线粒体中增强复合物I的功能并促进NAD⁺的产生进而增强线粒体的功能。相反的,乙酰化的MRPS5向细胞核聚集导致糖酵解相关蛋白的表达水平升高并促进了Warburg效应。因此,通过MRPS5的双重作用,肝癌干细胞完成了从线粒体呼吸作用为主的能量代谢方式向Warburg表型的转换。所以SIRT1/MRPS5轴是肝癌代谢的关键调控轴。临床病理的相关分析进一步发现相较于SIRT1^Low/Nuclear-MRPS5^High表型,具有SIRT1^High/Cytoplasmic-MRPS5^High表型的肝癌病人预后差,且SIRT1/MRPS5标新在判断非复发病人的预后中具有较高的权重,从而揭示了SIRT1/MRPS5调控轴的临床意义。