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研究背景和目的缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）时脑组织发生缺血再灌注（ischemic/reperfusion,I/R）损伤,细胞凋亡是I/R损伤后的主要表现之一。因此,IS中神经元凋亡机制的研究被神经科学研究工作所重视。前期研究结果发现,I/R引起ANXA1磷酸化修饰水平增加,ANXA1核转位增加并辅助促凋亡因子bid转录活性,导致细胞凋亡。在对ANXA1苏木化修饰研究中发现,苏木化修饰的ANXA1通过增强小胶质细胞内IKKα自噬降解,降低OGD/R诱导的小胶质细胞炎性因子产生,改善I/R损伤小鼠的神经功能缺损。除磷酸化修饰和苏木化修饰,ANXA1分子还具有乙酰化修饰位点。近年的系列研究显示,去乙酰化酶sirtuin 2（SIRT2）加重卒中模型动物神经功能缺损并增加神经元细胞凋亡,SIRT2去乙酰化作用能使其下游靶蛋白乙酰化水平降低。我们的研究目的是探讨SIRT2介导的ANXA1蛋白乙酰化修饰在I/R引起的神经元凋亡中的分子效应及其机制。研究方法（1）利用氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）细胞模型和大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）动物模型模拟IS后的I/R损伤。（2）通过位点突变技术构建ANXA1突变质粒,包括模拟ANXA1乙酰化修饰（ANXA1 K312Q）和模拟ANXA1去乙酰化修饰（K312R ANXA1）质粒。（3）利用免疫沉淀法（IP）检测ANXA1蛋白的乙酰化水平和CASP3和CASP9蛋白的磷酸化水平。（4）利用免疫共沉淀法（CO-IP）检测乙酰化ANXA1介导的两个蛋白的结合与相互作用。（5）利用核浆蛋白抽提技术,检测OGD/R后不同乙酰化修饰水平的ANXA1蛋白的核浆分布。（6）利用Western blot法和RT-PCR法检测乙酰化修饰ANXA1对细胞中相关蛋白质水平和m RNA水平的调控,利用免疫荧光技术检测细胞中ANXA1和SIRT2蛋白的共定位。（7）OD405nm分光光度度法检测OGD/R条件下乙酰化ANXA1介导CASP3和CASP9对下游底物的剪切水平。（8）应用高通量蛋白质组学,分析OGD/R后乙酰化ANXA1对细胞中蛋白的差异表达、GO富集和KEGG通路富集。结果1.OGD/R或MCAO/R促进ANXA1与SIRT2结合并引起ANXA1乙酰化水平降低,SIRT2抑制剂AGK2能翻转OGD/R或MACO/R引起的效应为了明确OGD/R条件下ANXA1是否与SIRT2存在相互作用,首先利用CO-IP观察OGD/R后ANXA1蛋白与SIRT2结合及ANXA1乙酰化水平变化。结果显示:OGD/R后ANXA1蛋白与SIRT2结合显著增加;相应的,ANXA1蛋白乙酰化修饰水平显著降低。过表达SIRT2后,OGD/R诱导的ANXA1蛋白乙酰化水平的降低被进一步下拉;反之,予以AGK2抑制SIRT2酶活性后,OGD/R引起的ANXA1蛋白乙酰化水平降低被明显翻转。在小鼠脑MCAO/R动物模型中,在体对ANXA1蛋白与SIRT2结合及ANXA1蛋白乙酰化水平变化进行观察,结果提示:（1）IF结果提示小鼠海马区ANXA1与SIRT2存在共定位;（2）MCAO/R处理显著影响小鼠海马区ANXA1蛋白乙酰化水平变化,IP结果表现为:与对照侧相比,缺血侧（MCAO/R侧）ANXA1乙酰化水平显著降低;尾静脉注射AGK2后,MCAO/R引起的小鼠缺血侧海马区ANXA1蛋白乙酰化水平降低被明显翻转。2.OGD/R诱导ANXA1核转位增加,而ANXA1乙酰化修饰及AGK2抑制SIRT2酶活性均能减少OGD/R诱导的ANXA1核转位,增加ANXA1胞浆内募集。为了研究ANXA1乙酰化水平改变对OGD/R后ANXA1亚细胞分布的影响,利用OGD/R细胞模型和AGK2抑制SIRT2酶活性,检测HEK293T细胞中ANXA1蛋白的核浆分布。结果显示:与对照组相比,OGD/R处理引起ANXA1细胞核分布显著增加,胞浆分布显著减少;AGK2预处理HEK293T细胞后,OGD/R引起的ANXA1核浆分布异常被显著翻转,与OGD/R组相比,AGK2+OGD/R组的ANXA1核转位明显减少,而在细胞浆内分布显著增加。通过Uniprot和Phospho Plus数据库比对,ANXA1潜在乙酰化位点分别为K58、K71和K312位赖氨酸残基（K）。为了明确ANXA1与SIRT2的相互作用的去乙酰化位点,分别构建了ANXA1乙酰化沉默的突变质粒K58R ANXA1、K71R ANXA1和K312R ANXA1,利用CO-IP技术观察SIRT2与ANXA1关联的作用位点。CO-IP结果显示,在ANXA1乙酰化沉默的3个突变质粒中,SIRT2与K312R ANXA1的结合水平显著低于K58R ANXA1和K71R ANXA1,提示ANXA1的K312位点是SIRT2作用于ANXA1的主要靶位点。随后,构建模拟ANXA1乙酰化的突变质粒K312Q ANXA1,在HEK293T细胞中过表达WT ANXA1、K312Q ANXA1和K312R ANXA1,Western blot观察其核浆分布,结果显示:OGD/R刺激下,与WT ANXA1相比,K312Q ANXA1在细胞浆内聚集显著增加,且核转位减少;与K312Q ANXA1组比较,K312R ANXA1在细胞浆内明显减少,其核转位较K312Q ANXA1明显增加。3.AGK2预处理改善MCAO/R小鼠的神经功能缺损体征,修复MCAO/R引起的学习记忆能力降低利用神经功能缺损评分、疲劳转棒实验和Morris水迷宫实验（Morris Water Maze,MWM）,检测AGK2预处理能否改善MCAO/R小鼠神经缺损体征及学习功能缺失。神经功能缺损评分结果提示小鼠在MCAO/R后表现出明显神经功能缺损体征,而假手术组在MCAO/R后各项神经体征未见明显异常;AGK2抑制SIRT2活性后能改善MCAO/R引起的小鼠神经功能缺损体征,与DMSO+MCAO/R组相比,AGK2+MCAO/R小鼠神经功能缺损评分显著降低。疲劳转棒实验结果与神经功能缺损评分一致:AGK2+MCAO/R组小鼠的掉落潜伏期明显短于MCAO/R组小鼠。MWM检测动物空间定向与记忆功能,检测结果显示AGK2能明显改善MCAO/R小鼠空间记忆能力:在6天巡航定位期和第7天测试期,AGK2+MCAO组实验鼠的逃避潜伏期明显短于DMSO+MCAO组实验鼠,第7天的平台探索次数AGK2+MCAO组实验鼠比DMSO+MCAO组实验鼠的显著增多。4.过表达乙酰化ANXA1（K312Q ANXA1）能够抑制OGD/R诱导的凋亡相关蛋白CASP3和CASP9活性为了进一步探明ANXA1乙酰化水平对OGD/R后细胞凋亡是否有影响,利用高通量蛋白质组学分析OGD/R条件下WT ANXA1组和K312Q ANXA1组与凋亡相关蛋白的差异表达。GO富集分析发现与线粒体凋亡通路和对凋亡程序调节相关蛋白出现差异表达;KEGG通路富集结果也提示,凋亡通路相关蛋白富集。蛋白质组学的结果提示了OGD/R条件下,K312Q ANXA1对细胞生物过程的调控与凋亡程序,尤其是线粒体凋亡途径密切相关。为了明确ANXA1乙酰化修饰对OGD/R后细胞凋亡相关蛋白的影响,分别在HEK293T细胞过表达WT ANXA1、K312Q ANXA1和K312R ANXA1,然后分别用Western blot和OD405nm分光光度法检测CASP3蛋白的剪切体表达和活性。Western blot结果显示:与WT ANXA1组和K312R ANXA1组比较,OGD/R处理后,K312Q ANXA1组CASP3活性形式cleaved CASP3蛋白明显减少。OD405nm分光光度法比色法检测CASP3活性结果与Western blot结果一致,K312Q ANXA1过表达能够显著降低OGD/R后CASP3底物Ac-DEVD-p NA的OD405nm。对CASP3上游剪切酶CASP9检测结果显示:与WT ANXA1组比较,K312Q ANXA1过表达能够显著降低OGD/R后CASP9底物Ac-LEHD-p NA的OD405nm值。同时,CASP9剪切体cleaved CASP9的蛋白水平也显著降低,但CASP9上游剪切酶t Bid蛋白水平无明显变化。这些实验结果提示,K312Q ANXA1有抑制OGD/R损伤诱导的细胞凋亡的潜质。5.K312Q ANXA1下调PRKAR2B（PKA调节亚基）蛋白水平,增加PKA激酶活性并促进CASP9丝氨酸残基磷酸化修饰如果K312Q ANXA1引起cleaved CASP9蛋白水平降低与上游剪切酶t Bid蛋白表达无显著关联,本论文进一步研究K312Q ANXA1引起CASP9剪切体蛋白水平降低是否与CASP9磷酸化修饰有关。在HEK293T细胞中分别过表达WT ANXA1和K312Q ANXA1,OGD/R后将细胞总蛋白进行高通量蛋白质组学分析,结果发现CASP9上游激酶之一,PKA的调节亚基PRKAR2B蛋白水平下调。根据蛋白组学结果,RT-PCR和Western blot技术分别对PRKAR2B和PRKACA（PKA催化亚基）的m RNA和蛋白表达水平进行分析,结果显示:（1）在OGD/R前后,PRKAR2B和PRKACA的m RNA表达和蛋白水平均无明显变化;但OGD/R后,K312Q ANXA1组PRKAR2B蛋白水平显著低于WT和K312R ANXA1组。IP检测PKA调节亚基PRKAR2B水平降低相应引起PRKACA去抑制,PKA激酶活性增强,IP结果证明了OGD/R后,与WT和K312R ANXA1相比,K312Q ANXA1过表达能够显著促进CASP9丝氨酸磷酸化水平,同时抑制了OGD/R诱导的CASP9蛋白与CASP3蛋白的结合。6.ANXA1乙酰化修饰引起ANXA1与PRKAR2B结合增加,并通过自噬机制促进OGD/R后PRKAR2B蛋白降解我们推测K312Q ANXA1在OGD/R条件下促进PRKAR2B蛋白降解,本研究继续研究PRKAR2B蛋白降解方式。首先通过蛋白质组学分析自噬蛋白差异表达,发现OGD/R后,促自噬调节蛋白AMBRA1在K312Q ANXA1组高于WT ANXA1组,同时Western blot结果验证了组学结果。为了证实K312Q ANXA1在OGD/R条件下促进PRKAR2B蛋白发生自噬降解,本研究分析LC3Ⅱ蛋白表达变化,结果发现OGD/R后K312Q ANXA1组LC3Ⅱ蛋白水平显著增加。同时利用CO-IP技术,发现K312Q ANXA1和PRKAR2B的结合显著增加。自噬抑制剂NH4CL可以翻转K312Q ANXA1引起PRKAR2B蛋白水平下调。由此推测,K312Q ANXA1在OGD/R条件下促进PRKAR2B蛋白降解机制与蛋白自噬发生有关。结论OGD/R条件下,ANXA1蛋白乙酰化水平下降。K312Q ANXA1通过下调CASP9上游蛋白激酶PKA的调节亚基PRKAR2B蛋白水平增强了PKA的激酶活性并促进了CASP9的丝氨酸磷酸化水平,抑制CASP9和CASP3的剪切与活化,减少OGD/R损伤后细胞凋亡。