铜作为一种必需的微量元素，在生物体生长发育中具有着重要的功能，包括参与多种酶的激活、血浆铜蓝蛋白的合成、胶原蛋白的合成等。因此铜在体内稳态的失衡会导致很多疾病和发育缺陷，如贫血、周围神经病等。由于铜(包括CuNPs和Cu2+)在生产生活中被广泛应用，由此造成环境中铜污染问题已经十分严重，而铜污染会对鱼类及人类的健康造成不良影响。目前已经有大量的研究评估了铜对水生生物的影响，例如我们的早期研究也发现铜会造成斑马鱼胚胎发育畸形，包括脊柱弯曲变短、眼睛变小、运动功能受损等。然而有关铜造成胚胎发育缺陷相关分子和遗传机制的研究仍然较少。本研究以模式生物斑马鱼为研究对象，通过对刚受精的斑马鱼胚胎进行铜暴露，运用苏木素和伊红染色(hematoxylin-eosin staining，H&E)、透射电镜(transmission electron microscope，TEM)、转录组测序(RNA-seq)、整体原位杂交(whole mount in situ hybridization，WISH)、荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫荧光(immunofluorescence，IF)、蛋白免疫印迹(western blot，WB)等研究方法探讨铜胁迫下斑马鱼视网膜、肠道以及血管发育缺陷以及铜调控这些发育缺陷的分子机理。同时，我们使用两种铜转运突变体(cox17-/-和atp7a-/-)研究铜诱导斑马鱼视网膜和肠道发育畸形的潜在遗传和生物调节机制，为铜胁迫及铜稳态改变条件下胚胎发育缺陷及疾病的产生提供一定理论基础。本文的主要研究结果如下：
　　1铜通过诱导氧化应激(oxidative stress)和内质网应激(ER stress)造成斑马鱼视网膜和肠道发育缺陷
　　基于表型的观察、H&E染色和TEM的结果，本研究发现铜胁迫会造成斑马鱼胚胎眼部的发育不良、即明显的小眼畸形。此外铜胁迫的斑马鱼肠切片中观察到了受损的肠细胞；通过对铜胁迫下斑马鱼胚胎表达谱数据的分析，我们发现铜胁迫会下调视网膜和肠相关基因的表达；WISH、RT-PCR以及IF结果揭示铜会显著影响肠和视网膜三层细胞标记的表达，尤其是视锥/视杆细胞标记；且通过检测细胞分裂和凋亡发现铜会造成视网膜细胞的凋亡而不影响细胞分裂，揭示凋亡可能是造成发育缺陷的主要原因。接下来，通过斑马鱼视网膜和肠道细胞TEM观察，我们发现铜胁迫会造成线粒体和内质网结构的损伤；WB、WISH、RT-PCR和IF的结果显示铜胁迫胚胎中存在上调表达的氧化应激和内质网应激标记；而通过添加内质网应激拮抗剂及抗氧化剂可以显著恢复铜胁迫造成的视网膜和肠道缺陷。这些结果揭示铜是通过内质网应激和氧化应激造成的胚胎发育缺陷。
　　2COX17和ATP7A功能缺失影响铜胁迫造成的视网膜和肠发育缺陷
　　电镜观察发现cox17-/-突变体及铜胁迫的cox17-/-突变体视网膜具有正常的线粒体和内质网结构，而在cox17-/-突变体肠道细胞中仅观察到了轻微肿胀的线粒体，且在铜胁迫后线粒体和内质网都产生了明显的损伤；WISH、RT-PCR及IF发现与野生型胚胎对比，cox17-/-突变体的胚胎中氧化应激和内质网应激水平没有明显的变化，且在铜胁迫的cox17-/-突变体仅观察到轻微上调的内质网应激；对cox17-/-突变体视网膜和肠道标记基因表达的WISH和RT-PCR检测发现，铜胁迫仅会造成肠道标记基因的下调而不改变视网膜标记基因的表达；这表明铜胁迫造成视网膜及肠道缺陷依赖于铜诱导产生的氧化应激和内质网应激。电镜观察发现atp7a-/-突变体及铜胁迫的atp7a-/-突变体视网膜具有正常的线粒体和内质网结构，而在atp7a-/-突变体肠道细胞中观察到了严重肿胀及内膜消融的线粒体，铜胁迫后出现了更严重的肿胀线粒体但是结构正常的内质网；WISH、RT-PCR及IF发现与野生型胚胎相比，atp7a-/-突变体胚胎中氧化应激和内质网应激的水平都有明显的增加，然而在铜胁迫的atp7a-/-突变体胚胎中应激的水平都出现了下调；而通过IF在铜胁迫的肠道中我们则观察到了明显的氧化应激产生。这表明铜造成视网膜缺陷需要完整的ATP7A转运功能，而atp7a-/-突变体肠道中的铜累积产生的氧化应激是造成发育缺陷的主要原因。
　　3铜可能通过下调foxm1表达诱导斑马鱼血管发育缺陷
　　通过对铜胁迫的斑马鱼进行显微观察，我们发现铜胁迫的斑马鱼胚胎存在体节间血管血流阻塞；铜胁迫下胚胎表达谱分析结果表明铜会下调血管生成相关基因的表达；通过对铜胁迫的人静脉内皮细胞(HUVECs)的迁移的检测，我们发现铜胁迫会影响HUVECs的迁移，说明铜可能是通过抑制内皮细胞的迁移造成血管出芽；RT-PCR检测到下调表达的血管出芽基因验证了这一结论；接下来我们通过对foxm1MO斑马鱼胚胎进行观察，发现foxm1MO的斑马鱼胚胎存在同样显著的体节间血管血流阻塞，RT-PCR也检测到了下调表达的血管出芽相关基因，这些结果说明铜可能是通过下调foxm1的表达诱导斑马鱼血管的发育缺陷。