论文部分内容阅读
研究目的:A组链球菌（Group A Streptococcus,GAS）又称为化脓性链球菌（Streptococcus Pyogenes）,是致病力最强的链球菌之一,能产生多种毒素,除引起侵袭性和非侵袭性感染外,反复感染还可以出现感染后的自身免疫性疾病,导致严重的临床后果。尽管青霉素仍然是GAS感染的一线用药,但是治疗失败率高,且近年侵袭性GAS感染率仍逐年上升,给全球带来了沉重的医疗负担,GAS疫苗是预防和治疗疾病最有效的方法。然而细菌血清型众多,且可能与人体正常组织发生交叉反应,给疫苗的研发带来具大的挑战,至今尚未有疫苗批准上市。M蛋白是GAS的主要毒力因素,其结构内含有C区,不同GAS菌株血清型之间序列高度保守,针对该区域研发的疫苗具有广谱性。既往研究显示M蛋白C3区含有最小B细胞表位J8i,将其嵌合于酵母DNA结合蛋白GCN4中获得α螺旋结构,称为J8。前期我们以脂质体为载体已经成功合成出J8-Lipo-DT,近年还发现了与J8具有共同母肽段的p*17。本研究将在J8-Lipo-DT的基础上,分别从抗原肽段、佐剂和免疫方式三方面对GAS疫苗进行全面深入探讨和改进,筛选出理想的疫苗合成方法,搭配合理的给药途径,实现免疫原性的最大化和毒副作用的最小化,力求加快推进GAS疫苗临床试验的进程。研究方法:（1）以J8肽段为基础合成J8-Lipo-DT,通过鼻吸入免疫小鼠,了解对GAS菌株上呼吸道感染的保护性,并应用白细胞介素（interleukin,IL）-1β敲除小鼠,探讨IL-1β在脂质体疫苗诱导免疫中发挥的作用。随后分别通过添加PHAD佐剂以及更换抗原肽为p*17,制备含PHAD的J8相关脂质体疫苗和p*17相关脂质体疫苗,进一步筛选候选疫苗。（2）头对头研究对比p*17-DT/Lipo-PHAD和p*17-DT/CAF01两种结合疫苗的免疫原性和保护性,分别通过菌落计数和流式细胞术方法体外检测疫苗抗血清与GAS菌株的结合能力。（3）采用prime-pull免疫策略对h CD4.IAE-/-.DR3-DQ2.B6人源化小鼠给予p*17-DT+K4S2-DT/CAF01免疫,评价其免疫原性,并给予emm75菌株攻毒模拟人类GAS上呼吸道感染及评估p*17-DT+K4S2-DT/CAF01的保护作用。另取一组免疫完成静息至抗体滴度回落后的小鼠,给予低剂量cov R/S GAS突变菌株或者抗原肽再次刺激,复测其抗体水平、体外检测细胞因子以及用ELISPOT方法检测分泌特异性抗体的B细胞数,了解疫苗的长程免疫记忆。研究结果:（1）J8-Lipo-DT鼻吸入免疫小鼠后可产生血清和唾液特异性J8抗体,上呼吸道M12菌株攻毒后疫苗组各组织器官菌落计数减少。给予IL-1β-/-小鼠鼻吸入免疫后,小鼠上呼吸道保护作用较野生型免疫小鼠弱,且体外刺激脾细胞所分泌的IL-17A也较野生型小鼠下降。在脂质体系统中添加PHAD成分,不论是J8-Lipo-DT PHAD还是J8-DT/Lipo-PHAD,抗体滴度均显著升高,攻毒后细菌负荷显著减少。更换抗原肽后,p*17-Lipo-DT一次鼻吸入免疫后抗原特异性抗体就开始升高,较J8-Lipo-DT反应迅速。三次免疫后两者上呼吸道保护作用相当。与J8相关脂质体疫苗类似,p*17-Lipo-DT PHAD和p*17-DT/Lipo-PHAD免疫原性均较p*17-Lipo-DT提高,可以抵御上呼吸道GAS感染,但仍然无法提供针对皮肤感染的有效保护。（2）p*17-DT/Lipo-PHAD和p*17-DT/CAF01头对头研究,prime-pull（皮下注射-皮下注射-鼻吸入）免疫方法可以显著提高抗原特异性抗体水平,p*17-DT/CAF01免疫小鼠抗体滴度显著高于p*17-DT/Lipo-PHAD组,既可以抵御GAS上呼吸道感染,也可以有效抵抗皮肤感染。DT的前期暴露不影响p*17-DT/CAF01的免疫原性。体外研究显示,p*17-DT/CAF01抗血清较其他佐剂p*17或J8相关脂质体疫苗抗血清与GAS的结合力更高。（3）覆盖cov R/S突变菌株的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01经prime-pull（肌肉注射-肌肉注射-鼻吸入）免疫后,h CD4.IAE-/-.DR3-DQ2.B6人源化小鼠可获得高滴度的p*17和K4S2特异性抗体,使用低致病性emm75菌株攻毒后显示出一定程度的保护作用。有DT前期暴露的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗组小鼠较无DT前期暴露疫苗组小鼠抗体滴度下降幅度减少。免疫后小鼠静息至血清抗体下降,给予低剂量cov R/S突变菌株再次刺激后,p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗组小鼠唾液腺分泌p*17特异性Ig G的细胞数较对照组显著升高;脾细胞分泌的TNF、IL-2、IL-6、IL-17A,疫苗组均较未接受免疫的小鼠显著升高,与新近免疫的小鼠之间无明显差异。研究结论:（1）J8-Lipo-DT鼻吸入免疫后可以有效抵御不同GAS菌株上呼吸道感染,可能通过IL-17,在IL-1β的协同下发挥作用。p*17-Lipo-DT鼻吸入免疫后保护作用优于J8-Lipo-DT,p*17可能是GAS疫苗更优选的抗原肽。PHAD可以显著提高脂质体疫苗的抗原性,在上呼吸道感染中起到更好的保护作用,但不论是含PHAD成分的J8相关脂质体疫苗还是p*17相关脂质体疫苗,单纯鼻吸入免疫尚不足以抵御异位的皮肤浅表感染。（2）Prime-pull免疫策略可有效的放大疫苗的保护作用,是理想的GAS疫苗免疫方式。不论是在体实验还是体外试验,p*17-DT/CAF01均较p*17-DT/Lipo-PHAD显示出更强的免疫原性和保护性,且DT前期暴露不影响p*17-DT/CAF01效价。p*17-DT/CAF01,可能是目前最有前景的GAS候选疫苗之一。（3）覆盖cov R/S突变菌株的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01 GAS脂质体疫苗经肌肉注射和鼻吸入联合免疫,在人源化小鼠中显示出一定程度的保护作用。p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗可有效产生免疫记忆,当再次受到细菌感染后可迅速产生免疫反应,唾液腺Ig G在上呼吸道感染的防护中起重要作用,TNF、IL-2、IL-6、IL-17A也参与了疫苗诱导的细胞免疫。