研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是起源于造血干/祖细胞的血液系统恶性肿瘤性疾病,髓系造血细胞表现出增强的自我更新能力,同时因为细胞分化和凋亡受到阻碍,造成幼稚细胞的集聚,所以正常的造血功能被严重破坏,成为进展非常迅速而且难以控制的恶性肿瘤。随着基础研究工作的深入开展及临床治疗手段的改进,AML的预后有了显著改善。然而,根据统计的五年生存率来看,六十岁以下成年患者约为30%到40%,而六十岁以上患者的该数值尚且不到10%。目前,AML的发病机制尚不完全明确,影响其发生发展的机体内外环境因素有待于进一步探索,治疗过程中出现的多药耐药现象的具体机制不明,以及完全缓解(complete remission, CR)后患者早期与晚期复发的原因更是研究难点。因此,针对AML发生发展、多药耐药及复发难治机制的研究,探索新的抗癌靶点,研发新型抗AML药物成为血液学领域重要任务之一。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1]是一种存在于真核细胞内催化聚ADP核糖化的蛋白质修饰酶,它的基本功能是修复DNA损伤。PARP-1被认为是探测DNA损伤的感受器,在DNA断裂时它会被迅速激活,通过自身不同的结构域识别并且结合到损伤处,催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解为尼克酰胺和ADP核糖,同时激活和催化各种受体蛋白分子的聚ADP核糖化作用,完成复杂的DNA损伤修复过程。除此之外,PARP-1能够结合转录因子、改变基因的甲基化以及调节染色体结构等,从而影响基因转录、细胞周期进展及细胞增殖和死亡过程。现有研究表明,PARP-1在乳腺癌、肝癌及鼻咽癌等肿瘤中过表达,并且与不良预后相关,但它在AML中的表达情况及对AML疾病进展的影响和具体作用机制尚不明确。本课题旨在明确AML患者骨髓标本中PARP-1的表达情况,通过小鼠体内实验研究其对AML疾病进展的影响,在AML细胞系Kasumi-1和1 THP-1增殖和凋亡中的作用,以及通过基因芯片筛选并证实PARP-1影响的具体分子通路。本课题研究内容为AML的基础研究提供新的思路,给临床诊疗工作提供更多可参考利用的生物学靶点。第一部分PARP-1在急性髓系白血病发生发展中的作用研究目的：研究PARP-1分子在成人AML患者及正常对照者的骨髓标本中的表达水平,分析其与临床预后的关系；通过构建AML模型小鼠,阐明PARP-1分子对AML疾病进展的影响。初步明确PARP-1分子在AML中的作用,并为后续深入探讨PARP-1在AM L中的分子机制打下基础。研究方法：1.标本收集：收集成人AML患者及健康对照者的骨髓标本并分离出骨髓单个核细胞冻存。2.实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)法检测PARP-1的表达水平：采用TRIzol法提取骨髓单个核细胞总RNA,应用PrimeScript RT reagent试剂盒将RNA逆转录为cDNA, SYBR Green法检测AML患者及健康对照者的骨髓单个核细胞中PARP-1表达情况,分析其与临床疗效的关系。3.AML模型小鼠的构建：从ATCC购买小鼠AML细胞系C1498,体外培养扩增,然后尾静脉注射至C57BL/6、鼠体内。通过外周血涂片、骨髓涂片及组织切片染色鉴定模型。4.体内研究PARP-1对AML小鼠疾病进展的作用。4.1病毒包装及细胞感染：包装携带绿色荧光蛋白(GFP)表达载体的慢病毒,感染C1498细胞系,72小时后用荧光显微镜初步观测感染效率。应用嘌呤霉素(puromycin)筛选获得稳定表达GFP的细胞(C1498-GFP),大量扩增培养,流式细胞术检测筛选效率。得到稳定的C1498-GFP细胞。4.2动物模型的构建及实验分组处理：6到8周龄雄性C57BL/6小鼠正常饮食饲养,将C1498-GFP细胞尾静脉注射到小鼠体内,构建AML动物模型。实验动物分为两组：对照组,腹腔注射生理盐水；实验组,腹腔注射PARP-1抑制剂PJ34。4.3小鼠一般状况观测记录：观察记录模型小鼠的精神状态,还有毛发是否粗糙和活动情况等,每五天称量一次体重。4.4小鼠体内AML细胞浸润情况检测：(1)麻醉处死小鼠后,解剖观察小鼠脏器肿大情况。(2)流式细胞术检测小鼠外周血及肝脏组织中白血病细胞的浸润情况。(3)组织切片H＆E染色,检测白血病细胞浸润情况。4.5生存曲线：记录小鼠生存时间,绘制生存曲线,分析PARP-1功能抑制对AML疾病进展的影响。研究结果：1. Real-time RT-PC R结果显示,PARP-1在AML患者骨髓标本中的表达水平显著高于健康对照者,不同分型之间没有显著统计学差异。PARP-1表达水平较高的患者治疗效果差。2.C1498细胞尾静脉注射C57BL/6小鼠成功构建小鼠AML模型。发病小鼠消瘦明显,毛发粗糙,活动减少,体重减轻；一部分模型小鼠外周血白细胞显著增高,另一部分明显降低,血小板均减少,血涂片及骨髓涂片可见肿瘤细胞浸润；肝脏肿大明显,部分脏器肿瘤浸润形成肿块；组织切片H&E染色可见肝、脾及肾脏内大量的肿瘤细胞；未经干预的模型小鼠于一月之内因疾病进展而死亡。3.抑制PARP-1的作用能够显著缓解AML小鼠疾病进展。3.1与对照组小鼠相比,实验组小鼠消瘦减轻,毛发粗糙不明显,活动较正常,体重减轻情况也明显改善。3.2实验组小鼠肝脾肿大程度较对照组减轻。3.3流式细胞术证实外周血及肝脏中C1498-GFP细胞的含量在实验组中均明显降低。3.4组织切片H&E染色结果显示,实验组小鼠的肝脏中C1498-GFP细胞浸润程度减轻。3.5实验组小鼠中位生存时间较对照组延长,两者分别为37.5天和23.5天。结论：1. PARP-1分子在AML患者骨髓标本中高表达,相对表达水平较高的患者治疗效果差,提示PARP-1可能参与AML的发生发展过程,并且在预后指导方面具有一定意义。2.通过动物模型初步证实,抑制PARP-1的活性,明显减轻肿瘤细胞的体内浸润程度,延缓AML的疾病进展过程,改善预后,因此干预PARP-1的活性有可能成为AML靶向治疗策略之一。第二部分PARP-1对AML细胞生物学行为的影响及作用机制研究研究目的：研究PARP-1印制对AML细胞系生物学行为及相关分子通路的影响；筛选并验证PARP-1抑制导致显著上调或下调表达的分子,分析PARP-1调节显著的基因功能和分子通路；明确下游分子在AML患者骨髓标本中的表达,与临床预后的关系,及对AML细胞存活及下游分子通路的影响；进一步分析验证PARP-1与下游分子的相互影响。深入探讨PARP-1参与AML发生发展的具体分子机制,为AML靶向治疗提供新的理论基础。研究方法：1. PARP-1抑制对AML细胞系Kasumi-1和THP-1细胞活力、周期、凋亡及相关分子通路的影响。1.1 CCK8法检测细胞活力：配制不同浓度梯度的PJ34溶液,分别加入Kasumi-1和THP-1细胞培养基中,孵育48小时,CCK8法检测并计算细胞存活率及IC50值；用分别携带PARP-1干扰序列及对照序列的慢病毒感染两种AML细胞系,验证干扰效率后进行常规培养,CCK8法检测24h、48h及72h的细胞活力,对比生长曲线。1.2流式细胞术检测细胞周期：收集PJ34处理48h后的两种细胞,碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。1.3流式细胞术检测细胞凋亡：PJ34处理细胞48h, Annexin V FITC/PI双染细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.4 Western blot检测周期蛋白、凋亡分子及下游通路分子的表达情况：收集处理后的细胞,提取细胞总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,western blot方法检测PARP-1抑制对细胞周期蛋白cyclinB1、CDK1、P27和细胞凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-xL以及AKT、ERK1/2通路的影响。2.筛选PARP-1下游分子及通路：应用表达谱芯片技术筛选PARP-1抑制后显著差异表达的分子,并初步验证芯片结果。利用GO富集分析法和KEGG通路分析法分析受PARP-1影响显著的基因功能和分子通路。3.研究PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。3.1 Real-time RT-PCR法：检测上述收集的AML患者及健康对照者的骨髓标本中MPL的表达水平,并分析其与临床疗效的关系。3.2病毒感染：构建MPL过表达及干扰病毒,分别感染Kasumi-1和THP-1细胞,western blot验证过表达及干扰效率。3.3 CCK8实验：正常培养过表达及干扰MPL分子的两种AML细胞,CCK8法检测细胞24h、48h及72h的细胞活力,绘制生长曲线。3.4 Western blot实验：检测干扰MPL分子对AML细胞内AKT、ERK1/2、JNK及P38MAPK通路的影响。4.进一步分析验证PARP-1与MPL的相互影响。4.1Real-time RT-PCR及western blot法验证PARP-1对MPL的调节作用：抑制或干扰PARP-1后,检测MPL的mRNA及蛋白表达水平的变化。4.2CCK8法及流式细胞术检测干预MPL对PARP-1作用的影响：用MPL的活化配体促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)刺激AML细胞或者用慢病毒感染AML细胞过表达MPL后,再检测PARP-1抑制对细胞的存活及凋亡的影响,分析MPL对PARP-1作用的影响。研究结果：1.PARP-1对AML细胞活力、周期、凋亡及相关分子通路的影响。1.1 PARP-1干扰抑制AML细胞活力：不同浓度梯度5、10、20、30和40μM的PJ34均能显著抑制Kasumi-1和THP-1细胞的增殖,导致部分细胞死亡,且具有剂量依赖性。PJ34对两种细胞的IC50值分别为23.5±3.9gM和35.6±5.5μM。利用慢病毒干扰PARP-1的表达,也显著抑制Kasumi-1和THP-1细胞的生长。1.2抑制PARP-1使细胞停滞在G2/M期：流式细胞术检测结果显示,PJ34处理细胞后,处于G0/G1和S期的细胞减少,而处于G2/M期的细胞显著增多。Westernblot检测周期蛋白显示,PARP-1抑制下调cyclin B1和CDK1的表达水平,上调P27蛋白表达,从而使更多的细胞进入G2/M期。1.3干扰PARP-1的作用增加AML细胞凋亡：PJ34处理细胞后,细胞凋亡率显著增加,且PJ34浓度越高凋亡细胞越多。Western blot检测显示,PJ34导致抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表达水平明显降低。1.4抑制PARP-1降低AKT1口ERK1/2通路的活化水平：在两种AML细胞中加入PJ34后,p-AKT/t-AKT和p-ERK/t-ERK的水平均明显降低。2.表达谱芯片结果及分析：筛选出PARP-1抑制后显著上调(>2倍)表达的分子18个,和显著下调(≤0.5倍)表达的分子9个。初步选取AML相关分子进行real-time RT-PCR实验,验证芯片结果可靠。GO富集分析提示PARP-1显著影响细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、黏附作用、细胞迁移、血管生成、免疫应答及转录调节等多种生理病理过程。KEGG通路分析提示PARP-1参与TCR信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路以及JAK/STAT信号通路等多种通路的调节。3. PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。3.1 MPL在AML患者中高表达,相对表达水平较高的患者治疗效果差。3.2 MPL促进AML细胞增殖：慢病毒过表达和干扰两种AML细胞中MPL的表达,蛋白水平证实了慢病毒过表达及干扰效率。培养感染后的细胞,CCK8实验检测显示MPL过表达组细胞增殖明显高于对照组,而MPL干扰组的增殖显著低于对照干扰组。3.3 MPL影响AKT和ERK1/2通路：干扰MPL表达后,细胞中p-AKT/t-AKT和 p-ERK/t-ERK水平降低,而p-JNK/t-JNK和 p-P38/t-P38水平没有明显改变,说明MPL干扰后抑制了AKT及ERKl/2通路的活化,而对JNK及P38通路无显著影响。4.验证PARP-1与下游分子MPL的相互影响。4.1 PARP-1抑制及干扰均能显著下调MPL的表达。4.2活化MPL信号能部分逆转PARP-1抑制在AML细胞中的作用：TPO处理细胞后,PJ34对AML细胞存活的抑制作用明显减弱；过表达MPL后,PJ34对AML细胞存活的抑制效应减弱,促进AML细胞凋亡的作用也减弱。结论：1.干扰PARP-1的作用能够抑制AML细胞的增殖活力、阻碍细胞周期进展、诱导细胞凋亡,与抑制AKT和ERK1/2通路的活化有关。2. PARP-1的下游分子MPL在AML患者中高表达,与不良预后相关；MPL能够促进AML细胞增殖,激活AKT和ERK1/2信号通路。3. PARP-1能影响MPL的表达,且干预MPL能部分逆转PARP-1抑制的作用。4、PARP-1及下游分子信号通路的活化在AML发生发展中发挥重要作用,抑制其过表达及活化可能成为AML的靶向治疗的新途径。