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研究背景与目的食管癌(Esophagus cancer,EC)是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,我国是食管癌的高发国家,其发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤前列,其中90%以上的组织学类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。食管癌早期症状不明显,尚无普遍认可的早期诊断筛查方法,临床上首次确诊的食管鳞癌患者80%以上已为中、晚期,尽管手术、放疗和化疗等治疗方法不断进步,但其5年生存率仅15%–25%,总体疗效仍不理想。因此,从分子水平进一步探讨食管癌发生发展,对食管癌的防治具有重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类约18-25个核苷酸长度的单链非编码RNA,调控基因的表达,介导肿瘤的发生发展过程,发挥着癌基因或抑癌基因的作用。微小RNA-146a(microRNA-146a,miR-146a)是miRNA家族中的一员,是当前研究较前沿、较广泛的miRNA之一,其在食管癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤增殖生长、侵袭和转移过程中作为癌基因还是抑癌基因尚无明确定论。本课题检测miR-146a在食管鳞癌细胞中的表达情况,探讨其对食管鳞癌细胞株恶性生物学行为的影响,探索miR-146a的生物靶标及其可能调控机制。期望能为食管癌的预防和治疗提供新的潜在靶点。方法 应用实时荧光定量聚合酶链式反应技术(Real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测3株人食管鳞癌细胞株(Eca109、KYSE140、KYSE150)和食管正常上皮细胞HEEC中miR-146a的表达情况。判定miR-146a在食管鳞癌中起癌基因还是抑癌基因作用,并筛选合适的细胞株作为靶细胞株进行后续研究。而后合成miR-146a的模拟物mimics或抑制剂inhibitor,利用脂质体Lipofectamine2000将其转入靶细胞株中,构建miR-146a过表达或抑制的食管鳞癌细胞模型。其后通过CCK8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞凋亡和周期、Transwell实验检测细胞侵袭能力以及划痕实验检测细胞迁移能力。利用相关生物信息学软件预测miR-146a的靶基因,并用双荧光素酶报告基因系统检测miR-146a与靶基因结合情况,RT-qPCR、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分别检测食管鳞癌细胞株中该靶基因mRNA和蛋白表达情况,分析二者与miR-146a表达水平之间的关系。结果1.miR-146a在食管鳞癌细胞株中的表达情况:RT-qPCR检测结果显示,miR-146a在3株食管鳞癌细胞株(Eca109、KYSE140、KYSE150)和食管正常上皮细胞HEEC中的相对表达量分别为0.36±0.05、0.16±0.06、0.09±0.02和1±0.05。miR-146a在3株食管鳞癌细胞株中(Eca109、KYSE140、KYSE150)的表达较食管正常上皮细胞HEEC明显降低(P<0.01)。选择表达量相对较高的食管鳞癌细胞株Eca109作为靶细胞株进行后续研究。2.过表达miR-146a对食管鳞癌细胞株Eca109增殖能力的影响:miR-146a过表达组为mimics组,阴性对照组为NC组,无处理组为MOCK组,采用CCK8法分别检测mimics组、NC组和MOCK组的Eca109细胞450nm处的OD值。结果显示,转染了miR-146a mimics的Eca109细胞的OD值在24h、48h和72h后明显较阴性对照NC组和空白对照MOCK组降低,mimics组细胞的增殖率较NC组和MOCK组低,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.过表达miR-146a对食管鳞癌细胞株Eca109凋亡的影响:通过流式细胞术检测各组食管癌细胞的凋亡情况,结果显示在转染48h后,mimics组的总凋亡率明显高于NC组和MOCK组(P<0.01)。4.过表达miR-146a对食管鳞癌细胞株Eca109周期的影响:通过流式细胞术检测细胞的周期情况,结果显示在转染48h后,mimics组较NC组和MOCK组G1期细胞减少(P<0.05),S期细胞无明显差异(P>0.05),G2/M期细胞明显增多(P<0.01)。5.过表达miR-146a对食管鳞癌细胞株Eca109侵袭能力的影响:Transwell侵袭实验结果显示,mimics组与NC组和MOCK相比较,Eca109细胞穿过小室的细胞数明显减少(P<0.01)。6.过表达miR-146a对食管鳞癌细胞株Eca109迁移能力的影响:划痕实验结果显示,mimics组较NC组和MOCK组细胞的迁移能力降低(P<0.01)。7.miR-146a靶基因的验证:通过Targetscan、MicroRNA.org、miRDB等相关生物信息学软件预测分析,miR-146a可与白细胞介素受体相关激酶1(Interleukin Receptor-Associated Kinase 1,IRAK1)的3’UTR区相关序列结合,IRAK1可能是miR-146a的直接靶基因。双荧光素酶报告基因系统结果显示,IRAK1 WT+miR-146a mimics组的荧光素酶活性较对照组明显较低(P<0.01)。8.过表达miR-146a对IRAK1表达水平的影响:转染mimics后,RT-qPCR实验结果显示IRAK1 mRNA的表达明显降低(P<0.01),Western blot检测结果表明IRAK1蛋白的表达水平降低(P<0.01)。结论 miR-146a在食管鳞癌细胞中的表达明显降低,其在食管癌中应发挥着抑癌基因的作用。miR-146a不仅可以抑制食管鳞癌细胞株Eca109的增殖生长、促进肿瘤细胞凋亡,还可抑制其侵袭、迁移能力。miR-146a通过抑制靶基因IRAK1的表达,调控其下游相关信号通路,从而发挥抗食管鳞癌细胞株Eca109恶性生物学行为的作用。miR-146a/IRAK-1抗食管癌调控机制的发现为食管癌的防治提供了一新的潜在靶点,值得深入探索。