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核酸适配体(aptamer)是一段DNA或者RNA序列,它能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合,因此被广泛应用于生物检测领域,其作用本质是一段单链核酸分子折叠形成特定的三维结构与靶标高亲和力和高特异性结合。相较于DNA适配体,RNA分子由于结构更“柔韧”,可以进行更复杂地折叠,与靶分子形成更多样的构型,在小分子检测领域中具有独特的优势。但是RNA分子的生物稳定性差,未化学修饰的RNA适配体应用于生物体液样品检测时会快速降解；因此迄今为止,RNA适配体未能在生物医学领域得到大规模应用。本论文选取了3个经典的RNA适配体,以它们作为模型,在其未与靶分子发生相互作用的序列中部截断,然后与有独特功能的纳米材料(纳米金、氧化石墨烯)相结合,发展一种自组装适配体纳米传感器。将这种自组装适配体纳米传感器应用于生物体液样品(血清、牛奶)的检测和手性分子的识别；当溶液中存在靶分子时,截断的适配体可以与靶分子结合,重新组装成适配体/靶分子三维结构；然后与纳米材料发生不同程度的相互作用,使得溶液的荧光值发生相应的变化,从而准确测定样品中靶分子的浓度。这种纳米传感器利用纳米材料的独特功能和截断序列的较短长度,提高了RNA适配体的生物稳定性,使开发基于RNA适配体的生物检测与传感技术成为可能；同时证明适配体与靶分子形成三维结构的序列保持完整,适配体就可以发挥作用；这将为未来发展适配体技术提供新思路。主要研究内容如下：1.检测血清中茶碱的RNA适配体传感器：茶碱的RNA适配体是一段包含33个核苷酸的RNA序列。在其中段仅起连接作用的rA17和rG18处截断,其中一个片段通过连接的多聚腺苷酸尾(poly A tail)快速吸附到纳米金表面,另外一个片段末端标记Cy3荧光基团。当将这种纳米传感器应用于血清中茶碱检测时,茶碱在纳米金表面驱动这两个片段快速自组装成适配体/茶碱三维结构,荧光基团Cy3靠近纳米金表面,荧光被纳米金猝灭。结果显示,茶碱浓度与荧光猝灭率成正相关,检测的线性范围为0-10μM,最低检测限0.05μM；这种传感器上的RNA适配体在核酸酶RNase I作用下能够稳定地存在,不容易被降解。即使血清中存在茶碱类似物咖啡因、可可碱,它们对检测结果的干扰小于9%。2.检测牛奶中新霉素B的RNA适配体传感器：根据新霉素B的RNA适配体与新霉素B在溶液中发生相互作用时的结构,将这种含有23个核苷酸的RNA适配体在核苷酸rA与核苷酸rG处截断。与上述的方法相同,其中一个片段通过连接的多聚腺苷酸尾(poly A tail)快速吸附到纳米金表面,另外一个片段末端标记FAM荧光基团。当牛奶中存在新霉素B时,新霉素B分子与这两段核酸片段在纳米金表面快速自组装成紧密的三维结构,导致FAM荧光基团被纳米金猝灭。溶液中新霉素B的浓度越高,FAM荧光基团的猝灭率也就越高,荧光值越小；当新霉素B的浓度在0至10μM时,荧光值降低的比例与之成线性相关,最低检测限为0.01μM。同样地,这种纳米传感器提高了连接RNA序列的生物稳定性,并且不受新霉素B结构类似物如巴龙霉素和卡那霉素干扰。3.识别手性药物的适配体纳米传感器：药物中存在的手性分子,往往由于其活性不同,需要进行识别和检测,但是由于其结构相同,对其进行识别与检测就成为分析化学上的一个难题。这项研究中沿用以上的策略,将由33个核苷酸组成的L-精氨酸RNA适配体在仅起连接作用的外环rA2和rA3处截断成两个片段,其中一个片段连接荧光基团Cy5,与氧化石墨烯溶液共混,通过π-π堆积作用被吸附到氧化石墨烯表面,Cy5的荧光被氧化石墨烯猝灭。在被检测溶液中加入另一个RNA片段,如溶液中存在L-精氨酸时,L-精氨酸使加入的RNA片段与吸附于氧化石墨烯表面的RNA片段形成一个完整的RNA适配体并与之缠绕成紧密的三维结构；吸附于氧化石墨烯表面的RNA片段得以从氧化石墨烯表面脱落,猝灭Cy5基团的荧光得到恢复；溶液荧光强度的大小与L-精氨酸的浓度成正比,其检测线性范围为1-40 mM,最低检测限为0.09 mM。同样,这种RNA适配体纳米传感器能够抵抗核酸酶RNase A的降解,并只能特异地识别L-精氨酸,对D-精氨酸及其类似物没有浓度响应性。根据以上原理,构建了检测D-血管升压素的DNA适配体传感器。随着D血管升压素浓度的升高,体系荧光值逐渐升高,其检测的线性范围为5-100μg/mL,最低检测限为1.67μg/mL,并且在L-血管升压素的干扰下,这种DNA适配体纳米传感器仍然能够高特异性地识别D-血管升压素。综上所述,本论文主要构建了一种自组装RNA适配体纳米传感器,它们能够特异性地识别底物,不受底物类似物或对映体的干扰,并能够在复杂的生物体液环境中保持稳定,不受核酸酶降解的影响。以上这些优势使得它们有希望被应用于临床样品的检测中。同时,可以依据这种原理针对其它目标,例如蛋白、细菌、病毒、细胞等设计其相对应的纳米传感器。因此,本文所叙以纳米材料为基础构建的自组装RNA适配体传感器具有广泛的应用前景。