【背景】随着我军实战化训练强度、难度不断增大,官兵在执行跳伞着陆、急行军奔袭等任务中,关节软骨常常受到过量的压力,导致骨关节炎（Osteoarthritis,OA）高发,已经成为平战时官兵非战斗减员的重要原因,是军事医学领域研究的重点。同时,OA也是老年人群常见疾病,文献报道,60岁以上老人罹患率超过10%,临床表现为关节区疼痛、僵硬、功能障碍等,已经成为世界首位致残性疾病。由此,急需研发OA的针对性治疗策略[1]。软骨细胞是成熟关节软骨组织中的主要功能细胞。软骨细胞对细胞外基质的合成与分解代谢失衡是造成OA中蛋白多糖含量下降、胶原网络破坏塌陷等典型病理变化的主要原因,而该功能受软骨细胞内关键基因调控[2]。课题组前期研究中发现,OA小鼠关节软骨内蛋白多糖、II型胶原含量下降,软骨菲薄、表面粗糙,在CKIP-1KO小鼠中出现相似症状,提示CKIP-1可能具有软骨保护作用,且CKIP-1基因人鼠同源率高,利于后期临床研究,有望成为治疗OA的新靶点。关节腔内注射（Intra Articular Injection,IAI）给药是目前OA临床药物治疗的重要方式,具有微创、简便、增加药物生物利用度、降低全身副作用等优势,是以CKIP-1为靶点的基因治疗的可行方式[3]。然而,其主要局限在于:（1）药物难渗透:关节软骨组织致密、无血管与淋巴管等通道,IAI后普通药物难以渗透入软骨组织内,而是被关节囊内的血管和淋巴管迅速、大量清除;（2）药物难直接作用于软骨细胞:软骨组织内软骨细胞体积占比不足10%,且散在分布,普通药物难以准确定位、作用于软骨细胞。是制约OA基因治疗的关键。文献报道,软骨细胞外基质是一种富含透明质酸（Hyaluronic acid,HA）的带负电荷的3D网状结构,而阳离子脂质体表面带正电荷,如能控制其颗粒直径小于3D网状结构空隙,则有望通过电荷作用,吸引并渗透入软骨基质,是CKIP-1基因治疗的理想载体[4]。同时,软骨细胞亲和肽（Chondrocyte affinity peptide,CAP）可有效地与软骨细胞相互作用,且不存在物种差异,与阳离子脂质体结合,有望实现CKIP-1向软骨细胞的靶向运输。由此,本课题拟在课题组前期研究基础上开展工作。首先,检测OA临床患者关节标本与OA小鼠模型中CKIP-1含量随OA病程发展的变化情况,并检测KO小鼠、CKIP-1低表达（LOW）及过表达（HIGH）软骨细胞系中相关信号通路变化,从而明确CKIP-1在OA中的作用,打牢基于CKIP-1的基因治疗的前期理论基础;随后,构建可靶向软骨细胞的阳离子脂质体（CAP-lipos）,包载CKIP-1过表达质粒（CAP-lipos-CKIP-1）,进行材料学基本表征,并重点检测CAP-lipos-CKIP-1的软骨组织渗透性、软骨细胞靶向性与安全性。最后,进行OA小鼠动物模型治疗,检测治疗前后各组间动物行为学、组织学差异,验证CAP-lipos-CKIP-1治疗效果。从而系统地从CKIP-1作用确证、材料构建及表征、动物治疗验证三个层面探明靶向软骨细胞阳离子脂质体包载CKIP-1过表达质粒治疗OA的可行性,为OA的临床治疗提供新方法。同时本课题研究成果也可拓展应用于颞下颌关节OA、软骨损伤修复等多种领域,为相关疾病治疗提供实验依据。【目的】本课题针对平战时OA发病率高、致残率高,急需针对性治疗策略这一关键问题,在课题组前期研究基础上,从CKIP-1与OA相关性、材料构建及表征、动物治疗验证三个层面研究并实现如下目的:（1）明确CKIP-1在OA中的作用;（2）研发可高效渗透软骨基质并靶向软骨细胞的基因治疗递送系统;（3）验证该新型靶向软骨细胞阳离子脂质体包载CKIP-1过表达质粒治疗OA的效果与可行性。从而为OA的临床治疗提供新方法。【方法】研究内容一（CKIP-1与OA相关性）:CKIP-1对OA病程及相关通路影响的研究（1）收集OA临床患者关节样本,基于OARSI评分标准,通过番红固绿染色技术将所收集样本由病变程度从轻到重,分为0,1,2,3,4,5,共6级,通过免疫组化染色技术检测各分级下CKIP-1的表达量。（2）采用内侧半月板失稳法（Destabilization of Medial Meniscus,DMM）构建小鼠OA模型,以模拟军事训练等关节应力改变引起的OA,于术后2,6,10周取材。通过HE染色、番红固绿染色技术对模型软骨损伤情况进行评估,并通过免疫组化染色技术检测各组CKIP-1的表达量,从而进一步明确CKIP-1是否对此类应力性OA产生影响;同时,采用老年小鼠模型,观察CKIP-1对老年性OA的影响;（3）采用KO小鼠,与野生型（Wild type,WT）小鼠对比,通过免疫组化染色技术对调控软骨细胞功能的经典信号通路进行检测,从而明确CKIP-1影响OA的可能机制;（4）采用慢病毒感染技术,构建CKIP-1 LOW及HIGH的ATDC5软骨细胞系,通过Western Blot技术对通路进行验证,并评估CKIP-1过表达对通路的影响与对OA的治疗潜力。研究内容二（材料构建及表征）:CAP-lipos-CKIP-1材料构建、表征及安全性检测（1）通过有机反应合成靶向软骨脂质膜材,并检测纯化,通过薄膜水化、脂质体挤压和室温孵育制备包载CKIP-1过表达质粒的靶向软骨细胞阳离子脂质体（CAP-lipos-CKIP-1）;（2）通过透射电镜观察CAP-lipos-CKIP-1形貌,通过粒度仪CAP-lipos-CKIP-1粒径,并通过zeta电位仪检测CAP-lipos-CKIP-1的带点特性;（3）将细胞膜深红色荧光探针（Di R）连接于该递送系统上,使该递送系统成红色荧光,局部注射入小鼠关节腔,取材后进行冰冻切片,通过荧光显微镜观察各组材料渗透入软骨组织内深度;（4）将上述带荧光递送系统与ATDC5软骨细胞系进行体外细胞孵育,并通过激光共聚焦显微镜检测其对体外软骨细胞的靶向作用,同时,注射入小鼠关节腔,通过小动物活体成像仪,检测体内靶向作用;（5）通过溶血实验检测该材料体外生物安全性,并通过尾静脉注射入小鼠体内,对小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要脏器取材进行HE染色,从而评估该材料体内生物安全性,为进一步的动物治疗验证提供基础。研究内容三（动物治疗验证）:CAP-lipos-CKIP-1对小鼠OA的治疗效果验证（1）小鼠DMM术后6周进行关节腔注射治疗干预,治疗组注射CAP-lipos-CKIP-1,对照组注射PBS,于治疗后1月、2月进行检测,通过免疫组化染色明确治疗后是否出现CKIP-1表达升高;（2）通过旷场实验检测小鼠活动的主动性及活动距离;利用转棒实验检测小鼠运动耐力及关节稳定性,从而从动物行为学角度检测小鼠关节功能恢复效果;（3）通过HE染色、免疫组化染色技术,评估各组小鼠关节组织结构与成分,从组织学角度检测小鼠OA治疗效果;【结果】研究内容一:（1）本课题共收集60例OA患者关节样本,具有OARSI评分标准中所规定OA病变严重程度全部6个等级,免疫组化染色发现,CKIP-1表达量与OA严重程度成反比;（2）DMM模型小鼠在术后6周时,即出现OA典型病理改变,主要为软骨菲薄、蛋白多糖含量减少、II型胶原（COL-II）减少、组织结构破坏、出现过度矿化等表现;同时,免疫组化染色发现,DMM模型小鼠中CKIP-1表达量显著下降,6周时,DMM模型小鼠较对照组小鼠CKIP-1表达减少62.45%;且随造模时间进行性加重,10周时DMM模型小鼠较对照组小鼠CKIP-1表达减少85.61%,与临床样本结果趋势相一致;此外,KO小鼠出现关节OA样改变,且随年龄进行性加重,与对照组差异愈发明显;（3）免疫组化染色发现,与WT小鼠相比,KO小鼠中软骨细胞调控经典信号通路TGF-β-SMAD2/3发生改变,SMAD2/3表达减少95.96%,磷酸化SMAD2/3（P-SMAD2/3）表达减少47.98%;（4）采用慢病毒感染法成功构建CKIP-1 LOW（表达量降低20.02%）及HIGH（表达升高65.54%）软骨细胞系,以ATDC5为标准对照发现,CKIP-1 HIGH组细胞内SMAD2/3表达量升高82.91%,P-SMAD2/3表达量升高10.71%。研究内容二:（1）成功构建CAP-lipos-CKIP-1;（2）CAP-lipos-CKIP-1粒径约为100nm,呈阳离子电荷特性,且大于30m V,满足本课题材料设计理念;（3）冰冻切片结果显示,游离Dir在关节腔中被快速清除,无荧光分布,非靶向材料荧光仅分布于软骨表层,而靶向组材料荧光分布广,可有效渗透进入软骨基质内部;（4）与ATDC5孵育24 h后,各组红色荧光均分布于细胞质内,且靶向组细胞质内荧光强度显著高于游离Dir或非靶向组,表明靶向组具有软骨细胞靶向性,且可提高细胞摄取。同时,小动物活体成像结果也显示,靶向组材料荧光强度及荧光保留时间均显著高于游离Dir或非靶向组,实现软骨组织内富集,并延长作用时间;（5）CAP-lipos-CKIP-1体外不会造成血液反应,且尾静脉全身注射后,小鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构正常,无全身毒性,生物安全性高。研究内容三:（1）CAP-lipos-CKIP-1治疗组小鼠活动距离与在转棒上持续运动时间均较对照组显著增加,表明CAP-lipos-CKIP-1治疗可有效缓解小鼠OA症状;（2）与对照组相比,CAP-Lipos-CKIP-1治疗后,CKIP-1表达升高42.46%;且关节软骨表面较为光滑、完整,软骨厚度较正常,软骨细胞数目较多,且辐射区软骨细胞呈柱状排列,与软骨表面垂直,胶原纤维排列整齐与骨长轴平行,软骨组织结构较正常;CAP-Lipos-CKIP-1组COL-II表达量提高62.23%,表明CAP-Lipos-CKIP-1治疗可保护软骨组织,具有OA治疗效果。【结论】结合课题组前期研究与本课题研究结果,可得出如下结论:1、通过对OA患者临床样本、OA动物模型、CKIP-1 KO小鼠及相关细胞系进行研究,我们明确了:CKIP-1下调是OA的重要致病因素,且CKIP-1下调程度与OA疾病进程一致,为OA的基因治疗提供了新靶点。2、通过结合阳离子脂质体（Lipos）与软骨细胞亲和肽（CAP）优势,可制备具有高效软骨组织渗透性、软骨细胞靶向性的基因递送系统（CAP-lipos）,实现软骨组织内富集,延长作用时间,并促进软骨细胞摄取。同时CAP-lipos具有良好的生物安全性,为靶向软骨细胞的基因治疗提供了新方法;3、利用上述递送系统包载CKIP-1过表达质粒（CAP-lipos-CKIP-1）,进行关节腔内注射治疗,可有效缓解OA模型动物症状,恢复关节功能,并在组织学水平切实保护关节软骨,促进修复,为OA的临床治疗提供了一种可行方案。