聚羟基脂肪酸酯(PHA)是生物体内合成的一类生物聚酯,PHA在具有生物活性的环境下可以被降解,因此具有广泛的应用价值,能够满足人们对化学品及原料工业的不同需求,从而在医药、农业等不同领域都有着广泛的应用。聚-3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA的典型代表,PHB的合成是以乙酰辅酶A为前体,利用NADPH提供还原力来进行的。在大肠杆菌中乙酰辅酶A的产生过程通常为:葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸后,丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧生成乙酰辅酶A,在丙酮酸脱羧的过程中会伴随二氧化碳的释放,从而造成了碳源的浪费。本实验中创新性地引入了 bifido途径的f/xpk基因[1]并构建PP-bifido途径来合成PHB,该基因能够催化F6P形成AcP和E4P,生成的E4P经过碳重排可继续生成AcP,从而使1mol F6P产生3mol AcP而没有碳源的浪费,生成的AcP在pta基因的作用下生成AcCoA并用于合成PHB。然而F/Xpk所催化的反应及碳重排过程中无法产生PHB合成过程中所需要的NADPH,经过分析我们发现,大肠杆菌PPP途径的氧化阶段可通过消耗1mol葡萄糖产生2mol NADPH并生成X5P,而bifido途径中的f/xpk为双功能酶,它可同时催化X5P生成AcP和G3P,G3P进入碳重排后继续生成AcP,此过程中仅有1mol CO2的放出,从而也在一定程度上减少了碳源的浪费。通过将f/xpk基因引入大肠杆菌中并经过适当的代谢改造,我们构建了 PP-bifido途径,进入该途径的代谢流流向分为两部分:一部分直接在f/xpk基因的作用下生成AcP并进而生成AcCoA合成PHB,经由此途径的代谢流可达到碳源的完全节省;另一部分经PPP途径的氧化阶段产生PHB合成所需的NADPH后在f/xpk基因的作用下生成AcP,进入该途径的代谢流可达到碳源的部分节省。当经由这两条途径的代谢流达到平衡时,可在不影响PHB合成的情况下最大程度上减少碳源的浪费,使以葡萄糖为底物的PHB合成的最大理论产率从原来的48%提高到64%。本文中将推动PP-bifido途径进行的两个不可逆反应的催化酶编码基因f/xpk及fbp加构建于质粒上过表达后与PHB生产质粒pBHR68共同转入到大肠杆菌DH5a菌株中,在37℃、120rpm的条件下进行摇瓶发酵,发酵结果显示引入NOG途径后PHB转化率与对照相比提高1.4倍,达到了 30.8%,从而证明了 NOG途径的成功引入且能够在一定程度上减少碳源的浪费。由于PP-bifido途径中需要PPP途径为PHB的合成提供还原力,但是大肠杆菌葡萄糖代谢的主要途径为EMP途径而进入PPP途径的代谢流较少,同时EMP途径也会与f/xpk基因竞争底物F6P造成葡萄糖利用率下降,因此我们敲除了EMP途径的关键基因pfkA以改变代谢流流向并解除底物竞争。此外,在PPP途径的氧化阶段,生成的6PG会进入ED途径产生G3P进而脱羧生成AcCoA并释放二氧化碳造成碳源浪费,因此我们同时敲除了 ED途径的edd基因以阻断该途径。在进行了上述改造后的DH5aAed△pfkA/pFF&pBHR68菌株其转化率与DH5a/pFF&pBHR68 菌株相比提高 1.2 倍,达到了 37.5%。通过对菌株相关途径的改造,PHB转化率已得到了进一步提高。但是我们发现,在葡萄糖经PTS途径运输进入细胞时会偶联PEP生成pyr从而为葡萄糖的磷酸化提供磷酸基团,但生成的pyr会脱竣生成AcCoA并释放出二氧化碳造成碳源的流失。而大肠杆菌的非PTS途径中葡萄糖的磷酸化由ATP的水解提供,不会造成碳源的浪费,因此,我们敲除了 PTS途径的关键基因ptsG,使葡萄糖经非PTS途径运输进入细胞,但是PTS途径的阻断造成葡萄糖吸收速率下降最终导致菌体生长情况变差且PHB百分含量降低。因此,为了解决上述问题,我们对非PTS途径的galP及glk基因进行了改造,但是如何使这两个基因的表达强度处于一个最佳水平成为了一个棘手的问题,经过查阅文献,我们发现采用MAGE的方法对这两个基因的RBS进行调控并结合适当的筛选方法及发酵检测可筛选出葡萄糖吸收速率恢复的菌株。将这两个基因的RBS设计为接近于标准SD序列的简并RBS并进行多轮电转将合成的ssDNA电转入细胞中进行重组。由于葡萄糖吸收速率的恢复会使PHB百分含量同时上升,因此通过PHB可与尼罗红染料结合显现红色且PHB百分含量越高红色越深这种筛选方法,我们筛选出了一株PHB百分含量基本恢复的菌株DH5α△edd△pfkA△ptsGGaalP,该菌株中仅galP的RBS发生了变化,在该菌株中转入pFF及pBHR68质粒并进行发酵条件优化后,在37℃、150rpm条件下并使用带挡板的摇瓶发酵时转化率最高达到62.2%,与未引入f/xAk基因的对照相比提高2.9倍。本实验的创新点在于着眼于提高PHB生产时的葡萄糖利用率,通过创新性地引入f/xpAk基因,设计PP-bifido途径,使传统PHB生产过程中浪费的碳源得以节省,从而在很大程度上降低了生产成本。在将该途径关键基因进行过表达、阻断相关竞争途径改变代谢流流向以及改造葡萄糖运输系统后,最终PHB的转化率从对照的21.8%提高到了 62.2%。