肿瘤的转移是癌症患者致死的主要原因,在病理学分期上,肿瘤的远处器官转移往往代表了疾病已发展到了晚期,部分患者往往已失去手术机会,5年生存率低。因此,在肿瘤转移发生的每一阶段,寻找一些起主要作用的分子和细胞,将有助于预防和控制肿瘤的转移。1889年,外科医生Stephen Paget针对肿瘤转移的器官特异性提出了肿瘤“种子-土壤”学说,而现在越来越多的研究和证据证实肿瘤转移需要肿瘤细胞与微环境的协调;同时也拓展了很多针对种子（如化疗）和土壤（如EGFR抑制）的治疗方案。形成转移灶之前的肿瘤细胞简称循环肿瘤细胞（CTC）,其在第二器官形成转移灶的过程十分复杂、艰难。目前被认可的肿瘤转移前微环境的概念,在2005年由Lyden教授提出,其研究发现血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1）阳性的骨髓祖细胞（Hematopoietic progenitor cells,HPCs）在肿瘤分泌的VEGF动员下,定植在有成纤维细胞和成纤维样细胞活化的区域,促进靶器官中肿瘤转移相关蛋白及趋化因子的分泌,促进了肿瘤的黏附、定植和生长,形成转移前微环境。转移前微环境概念一经提出便受到了极大关注,多种肿瘤来源的分泌物质TDSFs（G-CSF、TGF-β、TNF-α、LOX等）、细胞外基质及骨髓来源细胞（肿瘤相关巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等）被证实参与了转移微环境的形成。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）目前被认为是肿瘤微环境中占比最多的免疫细胞,它们不仅可以阻止T细胞攻击肿瘤细胞,还可以分泌各种细胞因子,诱导肿瘤细胞,促进肿瘤血管生成,诱导肿瘤细胞的定植和生长。巨噬细胞因表型和功能的差别,可分为M1型和M2型巨噬细胞,当下认为M1型参与炎症反应和抗肿瘤等免疫反应;M2型则发挥抗炎和促肿瘤的作用。在肿瘤转移前微环境中,M1型可转化为M2型,而肿瘤相关巨噬细胞更接近于M2型巨噬细胞的功能表型。巨噬细胞通过对微环境的调控从而促进肿瘤的转移。Kupffer细胞是一群位于肝窦状隙的免疫细胞,属于单核-巨噬细胞的成员,相当于定居在肝脏内的巨噬细胞。2015年Costa Silva等研究证明,胰腺癌来源外泌体能够选择性的被肝细胞Kupffer摄取,引起TGF-β1分泌和肝星状细胞表达纤维连接蛋白,纤维连接蛋白的沉积导致肝纤维化微环境的形成,促进骨髓来源的细胞的募集,形成了肝转移前微环境。并且他们发现,肝脏当中80%能摄取外泌体的细胞为F4/80+和CD11b+的巨噬细胞。胰腺癌是消化道恶性肿瘤中恶性程度极高的疾病,5年生存率极低,死亡率几乎接近发生率。大多数胰腺癌患者在早期无明显的临床表型,一旦确诊往往已处于癌症的中晚期,一部分患者常伴有肝脏转移而失去手术治疗的机会。目前,胰腺癌的发病机制仍未阐明,大量的研究表明胰腺癌微环境在肿瘤进展过程具有促进作用,并且与肿瘤的转移、耐药、免疫耐受等有密切关系。外泌体是一种直径为30-100nm的细胞外囊泡,内含DNA、RNA、蛋白质和脂质等多种生物活性物质,起着细胞间通信的重要作用。已有研究表明,肿瘤背景下的各种细胞都可以分泌外泌体,这些来源的外泌体与肿瘤的发生发展、侵袭转移和促血管生成有关。模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）是人体免疫系统识别内源性和外源性病原体并启动免疫应答的主要媒介,包括目前研究最多的Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）和维甲酸诱导基因-I（RIG-I）。Toll样受体在胞膜外区的部分可以识别受体及与其他辅助受体结合形成的受体复合物。TLRs是天然免疫系统的检察官,监视与识别各种不同的疾病相关分子模式（PAMP）,近期研究表明,细胞外囊泡（Extracellular vesicles,包括exosomes和microvesicles）可以作为TDSFs介导转移前微环境的形成,并且外泌体已被证实能够激活宿主细胞的多种TLRs（如TLR2、TLR4、TLR7与TLR8）,然后分泌细胞因子及趋化因子。所以转移前微环境形成之前,转移靶器官中的免疫细胞或基质上皮细胞等表达的PRRs（主要是TLRs）能够识别肿瘤来源的外泌体,从而引发炎症反应,趋化更多的骨髓来源细胞,协同形成转移前微环境。RIG-I作为重要的模式识别受体之一,主要起着识别细胞内病毒RNA和活化下游抗病毒免疫的功能,近来发现其在肿瘤发生发展中起着重要调控作用,如在乳腺癌中,RIG-I增强了乳腺癌治疗抵抗以及促进肿瘤侵袭转移。因此,基于以上的研究,我们采用胰腺癌肝转移的小鼠模型,探究肝脏中的转移前微环境的分子病理变化,并通过基因缺陷小鼠筛选起作用的模式识别受体,提出假设:胰腺癌来源的外泌体,驯化了肝脏转移前微环境中的巨噬细胞,即kupffer细胞。这些被驯化的肿瘤相关巨噬细胞可分泌细胞因子,促进了循环肿瘤细胞在此定植和生长。1.肿瘤来源外泌体驯化kupffer细胞促进趋化因子表达上调肝转移瘤模型最常用的建模方式是脾脏注射和肝内直接种植,在本课题中我们选择脾脏注射肿瘤细胞来建立肝转移模型。此法可以很好的模拟胰腺癌从他处释放、侵袭血管、侵犯血管内和驯化转移灶微环境直至肿瘤继发生长的一系列级联过程,从而塑造胰腺癌转移前微环境。实验所用到的细胞株包括人来源的BXPC3、Panc-1、CFPAC和小鼠来源的细胞株Pan02,分别注射到无胸腺裸鼠,即裸鼠,和C57小鼠,采用小鼠活体成像和活体解剖来观察胰腺癌肝转移情况和验证其确为胰腺肿瘤。结果显示,Pan02细胞系建模成功率最高,其次为Panc-1。活体荧光成像以及活检HE片子都显示了该癌细胞能通过一系列转移途径,最后定植到小鼠肝脏中。我们采用Pan02-C57、Panc-1-裸鼠两种小鼠模型,采用梯度分离法提取不同时期小鼠肝脏的kupffer细胞并通过流式细胞分选纯化,将提取的Kupffer细胞一部分用Trizol裂解保存,后续可进行转录组测序;一部分用Q-PCR法验证。测序结果显示,被驯化的Kupffer细胞,其多种趋化因子的表达量明显升高,且Q-PCR显示其中CCL3、CCL4、CXCL3、CXCL15等趋化因子在m RNA水平明显上调。这些趋化因子对肿瘤细胞的定植生长起到很大的作用。此外,我们搜集了临床样本,采用免疫组织化学方法验证,在胰腺癌微小肝转移灶中,CD68阳性的Kupffer细胞明显多于正常肝脏组织。最后,我们得出结论,在胰腺癌肝转移模型中,大量聚集的Kupffer细胞被驯化活化,从而引起了多种趋化因子的上调表达,进一步促进了肿瘤细胞的转移。2.外泌体通过My D88依赖的TLR4通路驯化Kupffer细胞促进胰腺癌肝转移为了探究肿瘤来源的外泌体对肝脏Kupffer细胞的活化作用和相关机制,我们提出提问,肿瘤来源外泌体中的何种有效成分激活的Kupffer细胞使其成为肿瘤相关巨噬细胞?Kupffer细胞被激活的机制和信号通路有哪些?我们首先采用体外培养肿瘤组织,然后使用超速离心法提取外泌体,采用电镜法鉴定其为直径30-100um的囊泡小体。其次,我们采用腹腔灌洗获得小鼠的腹腔巨噬细胞,将其在体外培养,贴壁,静息。为了探究不同浓度和不同时间条件下外泌体对巨噬细胞的活化作用,最后得到最佳刺激浓度和最佳刺激时间结果。根据此结果,我们还探究了是外泌体中的何种有效成分刺激了巨噬细胞,是DNA,RNA,还是蛋白?通过分别加入DNA酶,RNA酶和蛋白酶,我们得出结论,外泌体含有的蛋白对巨噬细胞的活化程度最明显。目前研究认为,模式识别受体是外泌体活动的下游受体,他们可以识别外泌体所携带的危险信号,从而启动免疫应答,包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR8以及RIG-I。为了研究外泌体活化巨噬细胞下游的信号通路,我们采用野生型和缺陷型小鼠进行比较,分别提取WT、TLR3^-/-、MYD88^-/-、TLR4^-/-、TLR7^-/-、TLR9^-/-、RIG-I^-/-小鼠的巨噬细胞,加以最适条件的外泌体刺激,然后观察巨噬细胞活化情况。最后发现模式受体TLR4为肝脏Kupffer细胞接受外泌体刺激的主要受体。