视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)是一种以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为主的遗传性视网膜变性疾病，发病率为1／3000．1／5000，是人类致盲的主要原因之一。其主要临床特征为夜盲、进行性视野缺损、眼底色素沉着和视网膜电图异常或无波等。RP原发于视网膜光感受细胞变性，并以光感受细胞凋亡为主要病理特征。此外，视网膜变性也可因外界因素引起。迄今为止，对此类疾病尚无有效的治疗方法。然而，随着在脊椎动物成体视网膜神经干细胞的发现，视网膜再生的研究已成为人们关注的焦点，MUller细胞作为一种潜在的视网膜干细胞也逐渐被认识。本实验通过建立MNU(N-methyl-Nnitrosourea)诱发的大鼠视网膜感光细胞损伤模型，研究视网膜损伤后的细胞凋亡情况以及各种生长因子的表达变化，并对lvlUller细胞的生物学特性变化进行研究。 一、研究方法和内容 1、通过MNU诱导视锥视杆细胞的凋亡，建立大鼠视网膜感光细胞变性模型。 2、应用HE染色观察模型大鼠视网膜的形态学变化；应用流式细胞技术及TUNEL法检测感光细胞的凋亡情况。 3、应用免疫组织化学方法，分别于建模后2d，5d和7d，检测核增殖抗原PCNA、神经前体细胞抗原nestin和感光细胞特异性抗原rhodopsin的表达情况，并对MUller细胞特异性抗原GS的表达进行双标。 4、应用逆转录聚合酶链式反应(RT．PCR)方法分别检测建模后1~7d，IGF，bFGF，HGF等神经营养因子以及细胞因子CyclinDl的表达情况。 5、采用胰酶消化法培养大鼠视网膜的MUller细胞，通过传代纯化，以神经胶质酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)为Muller细胞的特异性标志物，应用荧光免疫组织化学技术对培养的细胞进行鉴定。 二、结果 1、流式细胞仪检测显示，MNU注射后1d视网膜细胞凋亡率最高，达30％，以后细胞凋亡率逐渐下降，第2、3d的凋亡率分别为28％和11％，至5d左右凋亡现象消失。TUNEL法显示，MNU注射后第2d视网膜外核层出现成片凋亡的细胞。 2、免疫细胞化学染色显示，正常大鼠视网膜Muller细胞有GS表达，MUller细胞的轮廓清晰，细胞核位于内核层，突起呈典型的放射状，向内侧和外侧延伸，分别止于内界膜至外界膜。 3、MNU损伤后第2d及3d，外核层还比较厚，rhodopsin阳性表达细胞有很多层；损伤后第5d，外核层变得非常薄，rhodopsin阳性表达细胞也只有一层，细胞数量稀少；至损伤后第7d，rhodopsin阳性表达细胞虽也只有一层，但是细胞数量较第5d时增多。在损伤后第5d，未见GS和rhodopsin的共表达现象，而损伤后第7d，GS和rhodopsin的共表达现象则非常明显。 4、注射MNU后，大鼠视网膜内核层即开始有PCNA的表达，并与GS共存。PCNA的表达在MNU注射后第3d达最高峰，至5d左右PCNA的表达逐渐向外核层转移。与此同时，MUller细胞也开始表达神经干细胞抗原nestin，并且，随着损伤时间的延长，nestin的表达也逐渐增强。 5、腹腔注射MNU后，RT—PCR检测显示IGF，bFGF，HGF等生长因子以及CyclinDl的表达均有变化。与对照组相比，IGF，bFGF，HGF以及CyclinDl的表达均增强。 6、体外培养36h后，Muller细胞基本贴壁，伸出突起，并逐渐延长，10d左右细胞汇合，相邻细胞连接成网状。显微镜下可将细胞分为2层：底层细胞较大，折光性较弱，多为Muller细胞；上层细胞折光性强，有立体感，且分支较多，多为各种神经元。培养约4～5d左右细胞铺满培养瓶底后即可传代，传一代约需要5～6d左右。传2代后细胞呈单层，折光性弱，可见粗大的突起。 7、免疫荧光染色显示培养细胞大部分呈GFAP和GS阳性，表明为Müller细胞。阳性产物均匀分布于细胞胞体和突起中，突起较长，一般有多个，免疫阳性细胞在90％以上。 三、结论 l、在MNU诱导感光细胞凋亡，使Muller细胞被激活并进入增殖周期，从而表达PCNA，同时nestin也开始表达，GS的表达在损伤后逐渐减弱，提示在视网膜受到损伤时，Muller细胞开始增殖并转分化，具有干细胞的特性。 2、视网膜受到损伤后，IGF，bFGF，HGF等细胞因子的表达增高，且MUller细胞增殖活跃，提示视网膜损伤后可能通过大量分泌IGF、bFGF和HGF等细胞生长因子，促进MUller细胞的增殖。CyclinD~可活化Cdk4、Cdk6，驱动细胞周期通过起始点(startpoint)，即从GO期进XGl期，是G1期进程的重要调控子。本实验发现视网膜受到损伤后，CyclinD~的表达明显增高，提示大鼠视网膜MUller细胞已被激活进入细胞周期。 3、MUller细胞可经体外培养存活，细胞大部分呈GFAP和GS阳性。