抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多肽,广泛存在于生物体内。抗菌肽的抗菌机理与通过阻断细菌生物大分子合成的抗生素抑菌机理完全不同,细菌不易产生耐药性,因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。天蚕素是现有昆虫抗菌肽中最大的一族,具有抗菌谱广、毒副作用小、结构简单等优点,但是目前天蚕素的抑菌机理、结构与功能关系还不十分明确,这使的通过分子改造或全新设计生产,表达高活性抗菌肽的研究受到限制。本课题在前期研究天蚕素保守序列的基础上设计了四条抗菌肽AMP-A/B/C/D。本论文将通过基因工程技术在大肠杆菌中表达四种抗菌肽,研究各抗菌肽的抑菌活性,并且利用生物信息学方法初步分析抗菌肽的结构与抑菌活性关系,为今后设计、表达活性更高的抗菌肽提供技术资料。AMP-A/B/C/D全基因的合成及其克隆。根据大肠杆菌表达偏好密码子,将AMP -A/B/C/D多肽序列反翻译为核酸序列;采用分段化学合成的方法合成全基因序列的5个DNA片段;利用PCR反应将短的DNA片段连接起来,并引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和HindⅢ。四条全基因和载体PUC19分别经双酶切及连接反应,得到重组质粒PUC19-AMP-A/B/C/D。重组质粒转化“感受态”大肠杆菌JM109中,构建基因工程菌JM109 -A/B/C/D。测序分析表明四条抗菌肽全基因已经按照正确的阅读框插入到载体中。抗菌肽的诱导表达及溴化氰切割多肽。IPTG诱导工程菌并利用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物,结果表明表达产物以包涵体的形成存在。正交实验优化发酵条件后,大量培养工程菌。收集并破碎菌体,待菌体破碎完全后离心法分离得到包涵体。洗涤包涵体,除去附着的细菌膜蛋白等杂质。用6M盐酸胍/2M盐酸溶解包涵体,并加入溴化氰裂解表达产物,除去其N端的融合蛋白及部分信号肽。透析除去小分子后,冷冻干燥。利用稀释药敏实验和抑菌圈法测定设计抗菌肽抑菌活性。实验结果发现AMP-A没有抑菌活性;AMP-B/C/D均表现出广谱的抗菌活性,它们的最小抑菌浓度(MIC)约为9μM,其中AMP-C对革兰氏阴性菌的抑菌效果最强,AMP-D抗菌广谱性较AMP-B/C差。利用生物信息学对设计抗菌肽二级结构、两亲性、电场分布、跨膜区域进行预测。对四种抗菌肽的预测和抑菌活性的关系初步分析表明:AMP-A/B/C/D二级结构都以α-螺旋结构为主,AMP-C正离子性和两亲性较强,因此表现较高抑菌活性。