论文部分内容阅读
目的：探索一种有效的诱导方法将人脐血间充质细胞（Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUCBMSCs）在体外定向诱导分化为类雪旺细胞(Schwann cell，SC)。 方法：（1）用一次性塑料血袋（100ml，0.0048／ml枸橼酸、0.0132／ml枸橼酸钠、0.0147／ml葡萄糖）在无菌状态下采集足月妊娠、正常分娩或剖腹产胎儿的新鲜脐带血60-100ml。用0.5％羟乙基淀粉按1:4比例加入脐血中混匀，再按1:1比例加入磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）混匀。静置30 min后，吸取上清,离心沉淀红细胞。然后用密度为1.077g/ml的人淋巴分离液通过密度梯度离心法分离后，用吸管小心吸取中间白色膜状细胞层。用PBS洗涤后接种在加有人间充质细胞培养基（Medium for human mesenchymal stem cells， MESENCULTTM，含人间充质细胞基础培养基和刺激生长添加物）的一次性塑料培养瓶中，观察细胞形态并传代。（2）取培养的细胞，流式细胞仪检测细胞是否表达表面抗原 CD34、CD45、CD90和SH2。（3）实验方案的选择：参考诱导骨髓间充质细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）和脂肪间充质细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，A-DMSCs）分化为类SC的方法，设计六种方案。其中方案五为HUCBMSCs传至第3代，加入加有0.25mmol/mlβ-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、20ng/ml全反式黄酸（retinoic acid，RA）、2.5μmol/ml Forskolin、5ng/ml bFGF、20ng/ml PDGF、100 ng/ml HRG的不含胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified eagles medium，DMEM）培养24小时，然后换用10%FBS的DMEM培养液培养24小时，再换用加有上述诱导剂的培养液培养24小时，再换用10%FBS的DMEM培养液培养2d，再换10%FBS的DMEM培养液一次，培养2d。。在诱导7d后，计算出六种不同诱导方案的死亡细胞数和死亡率，统计六种不同诱导方案的死亡率之间的差异,取死亡率最小的方案五作为实验方案。（4）体外诱导HUCBMSCs向类SC分化。实验组，按方案五诱导；对照组不加诱导剂,用10% FBS的DMEM培养液培养，每隔2天换液一次。用倒置显微镜观察两组实验细胞形态，诱导7天后用抗S-100、GFAP和P75抗体做细胞免疫组织化学染色来鉴定诱导后HUCBMSCs是否具有SC的特征。 结果：（1）HUCBMSCs在体外培养梭形细胞为主，呈成纤维细胞形态，细胞平行排列或旋涡状生长，胞浆丰富，核大。（2）流式细胞仪检测显示细胞表达间充质细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）表面抗原CD90和SH2，不表达造血干细胞表面抗原CD34和白细胞表面抗原CD45。（3）在诱导7d后，计算出六种不同诱导方案的死亡细胞数和死亡率，统计六种不同诱导方案的死亡率之间的差异， p＜0.05，死亡率差异之间有统计学意义，取死亡率最小的方案五为实验方案。（4）加入诱导剂后有少量细胞死亡，加诱导剂的细胞免疫组化阳性，细胞胞浆中有棕黄色颗粒，而未加诱导剂的细胞免疫组化阴性,细胞胞浆呈蓝色。诱导后细胞免疫组化染色阳性率 S-10076.6%、GFAP81.9%、P7573.5%。 结论：HUCBMSCs可以在体外培养、增殖，并经β-ME、RA、Forskolin、b-FGF、PDGF、HRG在一定条件下联合诱导分化为类SC。