研究背景：中枢神经系统(central nerve system, CNS)损伤后的再生修复,是神经医学界始终关注的重大问题。传统观点认为CNS损伤后难以再生,而随着神经再生医学研究的发展,特别是干细胞特性的发掘与应用,为CNS损伤修复提供了新治疗策略。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)更由于可取自病员自体并可自身回输治疗而以取材方便、不涉及免疫排斥伦理,在修复CNS损伤策略中发挥了独特的治疗优势。众多研究表明,BMSCs修复CNS具有一定程度疗效且尚未发现毒副作用,然而,对BMSCs可以有效修复CNS的机理尚无统一定论。本研究从探讨BMSCs是否参与了CNS免疫调控、以及如何参与这种调控的角度,研究了BMSCs在修复CNS损伤过程中的作用机制。小胶质细胞是CNS内固有的免疫细胞,在许多CNS疾病的发生发展中发挥重要作用。小胶质细胞具有抗原提呈、吞噬病原体、分泌营养因子、保护神经细胞的作用。在正常的脑组织中,小胶质细胞处在一种“静止”的状态,但是当CNS受到破坏时,小胶质细胞能迅速地从静止状态转变为活化状态,并释放释放大量的炎性因子,引起机体强烈的炎症反应,导致组织的坏死。小胶质细胞被激活后,能产生更强的吞噬能力,在这种状态下,小胶质细胞甚至可以吞噬正常的神经细胞,从而引起CNS的破坏。多数研究证明,小胶质细胞的激活具有破坏性,它在许多CNS损伤性疾病及退行性疾病中起到了推波助澜的作用。BMSCs由于缺乏免疫原性,可以逃避机体的免疫清除。目前,BMSCs在CNS中的应用主要体现为在治疗外伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)和脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)中起到一定疗效作用。多数研究者认为这种治疗作用的机制是其替代作用,认为它可以分化为神经元、从而代替受损的神经元；或者通过神经营养因子分泌而达到保护作用。本研究考虑,CNS系统受损之后,BMSCs也有可能参与了修复过程中的免疫调控,由此探讨了BMSCs对小胶质细胞活性功能的调节作用,国内外尚鲜见相关研究方面的报道。研究目的：本实验中,我们用大鼠BMSCs作用于同种异体的小胶质细胞,来研究BMSCs对小胶质细胞活性的影响。通过不同的实验检测方法,判断小胶质细胞的增殖、分泌、吞噬、凋亡等细胞基本功能是否因BMSCs的影响而发生变化,并研究导致这些变化的可能机制。实验方法：1.依据传统的震荡法,提取高纯度的大鼠BMSCso将第3-5代细胞用无血清培养基孵育24小时,并分离24小时条件培养基。2.提取高纯度大鼠小胶质细胞。3.实验分组：(1)空白对照组；(2)脂多糖(LPS)刺激组；(3)条件培养基(CM)组；(4)LPS+CM组。4.用CCK-8试剂分析不同实验组的小胶质细胞在12、24、48、72小时的增殖活性变化。5.分别用ELISA法和Bio-Plex Pro Assays法,分析不同实验组的小胶质细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素-1β(interleuking-1β, IL-1β)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、干扰素-Y(interferon-y, IFN-Y)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor, RANTES).单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、单核细胞炎性蛋白-2(monocyte inflammatory protein-2, MIP-2)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)的变化。6.用流式细胞仪分析小胶质细胞表达CD11b和CD68的变化。7.用乳胶微粒吞噬实验研究不同实验组小胶质细胞吞噬功能的变化。8.分别用TUNEL法和流式细胞仪分析不同实验组小胶质细胞凋亡数量的变化。实验结果：1.成功分离了大鼠BMSCs并鉴定其纯度大于95%,第3代BMSCs表达典型的表面标志CD44(97.70%)和CD90(99.53%),同时不表达造血干细胞的表面标志CD34(1.81%)和CD45(4.86%)。2.成功分离了大鼠小胶质细胞并鉴定其纯度大于95%,提取的原代小胶质细胞表达小胶质细胞典型的表面标志CD11b(95.92%)。3.CCK8结果显示,在设定的时间点(12、24、48、72小时),LPS刺激的小胶质细胞相对于空白对照组的小胶质细胞,其增殖能力明显增高(LPS刺激组与空白对照组相比,在24、48小时,P<0.001；在72小时,P<0.01)。但是条件培养基组的小胶质细胞相对于空白对照组的小胶质细胞,其增殖能力明显降低(条件培养基组与空白对照组相比,在24、48、72小时,P<0.001)。此外,LPS+CM组的小胶质细胞,其增殖能力相对于仅LPS刺激组的小胶质细胞,其增殖能力也大大降低(LPS+CM组与LPS刺激组相比,在24、48、72小时,P<0.001)。4.乳胶微粒吞噬实验结果显示,LPS刺激组的小胶质细胞吞噬最多数量的乳胶微粒,条件培养基组的小胶质细胞吞噬乳胶微粒比空白对照组的小胶质细胞明显减少。LPS+CM组的小胶质细胞相对于LPS刺激组的小胶质细胞,其吞噬乳胶微粒的数量明显减少。5.将不同分组小胶质细胞孵育24小时后的上清液离心,以去除细胞碎片。通过ELISA法和Bio-Plex Pro assays法,分析其中TNF-a,IL-1β,IL-4,IL-6, IL-10,IL-17,INF-γ,RANTES,MCP-1,MIP-2和VEGF这些与炎症及免疫调控相关因子的含量变化。结果发现,小胶质细胞经过LPS刺激后,其分泌促炎因子如TNF-α(2275.53±393.15pg/ml)和IL-1β(1367.68±97.58pg/ml),趋化因子如RANTES(2395.06±203.42pg/ml)和MIP-2(1023.24±299.27pg/ml)的含量,相对于空白对照组明显升高(LPS刺激组与空白对照组相比,TNF-α,IL-1β和RANTES的含量差异具有统计学意义,P<0.001；MIP-2的含量差异具有统计学意义,P<0.01)；但在条件培养基组,这些因子的分泌(依次分别为384.36±45.67pg/ml、453.88±52.45pg/ml.157.35±34.68pg/ml和521.87±150.42pg/ml)相对于空白对照组,却明显减少。此外,LPS刺激组的小胶质细胞相对于空白对照组,也分泌有大量的抗炎因子如IL-6(3573.23±453.48pg/ml)和IL-10(41857.66±4839.85pg/ml),趋化因子如MCP-1(16008.96±3848.42pg/ml).实验也分析了条件培养基组和空白对照组分泌功能的差异,发现条件培养基组含有更多的IL-6(5521.85±328.49pg/ml).IL-10(80005.00±5387.94pg/ml)、MCP-1(15635.54±2493.98pg/ml)和VEGF(2020.41±537.84pg/ml),提示BMSCs分泌了大量的这四种因子。此外,四组上清液中几乎没有IL-4.INF-γ和IL-17的分泌。6.在不同的培养基孵育小胶质细胞48小时后,用流式细胞仪检测小胶质细胞表面受体的变化。实验发现,LPS刺激组小胶质细胞表达的激活受体CD68的比率(78.01%)比空白对照组(15.81%)明显升高。条件培养基组小胶质细胞表达激活受体CD68的比率(1.98%)则比空白对照组小胶质细胞明显降低。而小胶质细胞特有表面标志CD11b在各组之间的变化并不明显。7.用TUNNEL法检测凋亡细胞,结果显示,LPS刺激组凋亡的小胶质细胞占细胞总数的1.8%,不同于空白对照组的4.5%。条件培养基组的凋亡细胞数量占细胞总数的11.2%。Annexin V/propidium iodide (PI)染色结果与TUNEL染色结果相一致。实验结论：1、BMSCs能够抑制小胶质细胞的增殖能力、吞噬功能、炎性因子分泌；2、BMSCs可以抑制由LPS诱导的小胶质细胞表面激活受体表达；3、BMSCs诱导小胶质细胞凋亡；4、N0在BMSCs的免疫抑制作用中扮演重要角色。实验讨论：本实验证明了BMSCs具有维持小胶质细胞固有表型、并抑制小胶质细胞激活的特点。用BMSCs条件培养基孵育小胶质细胞后,无论活化状态还是静息状态的小胶质细胞,其增殖和吞噬能力都被减弱,表面激活受体的表达也会有所减少。通过检测小胶质细胞分泌各种细胞因子的变化,我们发现小胶质细胞分泌的多种促炎因子会被BMSCs条件培养基所抑制,而BMSCs自身具有分泌大量IL-6、IL-10、MCP-1和VEGF的能力。实验进一步研究BMSCs产生这种抑制作用的原因,发现BMSCs所分泌的一氧化氮(nitrogen monoxidum, NO)以及BMSCs具有的诱导其他细胞凋亡的特点,可能是导致这种抑制作用的主要原因。间充质干细胞的免疫抑制作用已经被许多研究者所证实,它可以抑制树突状细胞(dendrite cells, DC)和淋巴细胞的增殖。近年来,间充质干细胞被用于预防免疫排斥,以促进移植器官的存活。本实验中,我们主要研究了骨髓来源的间充质干细胞是否可以影响CNS内的小胶质细胞活性。鉴于小胶质细胞是CNS内发起免疫反应的代表性细胞,我们推断,BMSCs可以通过影响小胶质细胞的活性、从而对CNS起到免疫调节作用。实验表明,BMSCs显著地抑制小胶质细胞激活后所产生的促炎因子如TNF-a和IL-1β,趋化因子如MIP-2和RANTES。间充质干细胞对炎性因子的抑制,在一定程度上说明了间充质干细胞可以减弱由于小胶质细胞分泌所带来的损害。实验也进一步证实,BMSCs可以分泌大量的IL-6和IL-10,因此,这些抑炎因子也许是导致BMSCs抑制小胶质细胞增殖的原因之一。本实验还表明,BMSCs可以抑制激活的小胶质细胞的吞噬能力,并通过抑制小胶质细胞由于过度吞噬所导致的神经元非正常缺失,而起到保护神经元的作用。表面受体CD68的表达与小胶质细胞的活性密切相关,CD68的高表达被认为是小胶质细胞激活的标志。本实验发现,BMSCs可以抑制小胶质细胞表面受体CD68的表达,从而在另一个角度证明了BMSCs可以抑制小胶质细胞的激活。在探讨BMSCs产生免疫抑制效应可能机制的研究中,我们发现,BMSCs可以促进静息小胶质细胞以及激活小胶质细胞的凋亡,这种促凋亡的特点,是对间充质干细胞免疫抑制作用的一种解释,提示BMSCs不仅抑制小胶质细胞增殖,而且还能促进小胶质细胞的凋亡,对小胶质细胞的数量具有调节作用。在研究是否BMSCs分泌的NO也参与了对小胶质细胞的免疫抑制过程中发现,阻止BMSCs中NO的分泌后,其上清液对小胶质细胞增殖的抑制作用明显减弱,这种现象表明,BMSCs通过分泌可溶性因子而产生其免疫抑制作用,NO是其中一项重要的因素。综上所述,本实验证明了BMSCs可以维持小胶质细胞静息状态并抑制其激活。BMSCs不仅抑制小胶质细胞的增殖、吞噬和分泌能力,同时还可促进小胶质细胞凋亡；N0参与了BMSCs的免疫抑制效应。BMSCs拥有的免疫抑制能力显示,其可以减弱由小胶质细胞激活所带来的CNS损伤,从而保护CNS免受伤害。本实验从一定程度上提示,BMSCs在完成CNS损伤修复作用过程中的机制之一,就是通过对小胶质细胞的相关功能调控、来发挥对CNS内受损部位的保护作用。后续工作仍需有更多的动物体内实验,来进一步论证BMSCs的这种治疗作用及其机制。