研究背景和目的流行性乙型病毒性脑炎(Epidemic encephalitis B,简称乙型脑炎或乙脑),又称日本脑炎(Japanese encephalitis, JE),属于自然疫源性疾病,可导致人、猪、马发病,严重可死亡。乙脑的病原体为流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV,简称乙脑病毒)。乙脑病毒属于黄热病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒,为单股正链RNA病毒,长约11kb。病毒RNA只含有一个开放阅读框架(open reading frame, ORF),编码3个结构蛋白(C蛋白、PrM/M蛋白、E蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、 NS4b、NS5)。根据E基因区核苷酸序列,将乙脑病毒划分为分五个基因型(GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ)。2000年之前,GⅢ型是我国乙脑主要流行型；2001-2005年期间,GⅠ型和GⅢ型乙脑病毒混合流行；2005年之后则以GⅠ型为主要的流行型。乙脑在世界许多国家均有流行,但主要分布在亚洲,我国是高发地区之一,全国除了青海以外的省、直辖市均有乙脑病例的报道,局部地区时有暴发或者流行。猪是乙脑病毒重要的宿主,是人间乙脑的主要传染源,三带喙库蚊是主要传播媒介,乙脑病毒在猪-蚊-猪中存在一个基本的自然传播模式,或存在鸟-蚊-鸟自然传播模式,人偶然受到感染,是终末宿主。我国家猪饲养数量大,分布广,分散程度高,更新率高,蚊媒密度亦高,存在乙脑病毒传播的条件,如果不加以控制,乙脑病毒会长期在猪-蚊-猪中循环,威胁人类的健康。在乙脑疫苗未在人群中广泛应用的年代,猪血清乙脑病毒抗体达到50%时,3-4周后将出现人间乙脑发病的高峰,故进行猪的乙脑病毒感染流行病学监测可在一定程度上预测人间乙脑的发病情况。乙脑的预防,不仅有赖于降低人群易感性、消灭传播媒介,也要做好传染源的管理,做好源头控制。因此,了解流行季节家猪乙脑病毒感染情况,有利于充分掌握当前乙脑的流行因素,科学地做好乙脑的预防和控制工作。因此,本研究在华南部分地区对成年家猪乙脑病毒的带毒和血清抗体开展调查,了解家猪间乙脑的流行状况,以便为乙脑的防制提供科学信息。鉴于目前我国市场上的商品化猪JEV IgG抗体E LISA检测试剂盒品牌众多,质量参差不齐,给应用者选择带来了一定的困难,我们在本研究中也对目前国产主要商品化IgG抗体ELISA试剂盒的真实性和可靠性进行了评价。研究方法1.猪血样本的采集与处理2013年1月至8月期间,赴广东省、海南省和江西省部分地区的屠宰场或肉联厂无菌采集6-8月龄表观健康、未行乙脑疫苗免疫的家猪的血液样本。所有采集到的猪血液样本3000r/min离心15min,取离心后的血清混匀平均分装,一式3份,冰袋或者干冰运输回实验室后,-80℃保存待检。2.猪乙脑病毒IgG抗体诊断试剂盒评价选用三种常用的商品化猪JEV IgG抗体ELISA试剂盒(Keqian、Lvshiyuan及Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行平行检测,对结果进行诊断试验评价。ELISA试剂盒的检测严格按照各自说明书进行操作,微量中和试验严格按照中华人民共和国卫生行业标准WS214-2008的指导进行操作。3.猪乙脑病毒感染的流行病学调查3.1猪血清乙脑病毒检测和分离3.1.1 ELISA方法初筛猪血清样本乙脑病毒抗原阳性标本用商用猪血清JEV-Ag ELISA试剂盒初筛猪血清样本,严格按照试剂盒说明书进行操作。阳性者进一步进行病毒增殖和分离。3.1.2染毒BHK-21细胞单层乳仓鼠肾(Baby Hamster Syrian Kidney, BHK-21)细胞分别接种ELISA初筛为抗原阳性的猪血清样本,Minimum Essential Medium培养基(MEM)液为空白对照。持续观察7天后收集细胞病毒液,-80℃冰箱冻存待检。期间,若出现疑似细胞病变的现象,如细胞死亡或出现变圆、脱落、聚集等形态改变,初步判为阳性。若无细胞形态改变或改变不明显,盲传三代,如仍未有形态改变,且TaqMan Real-time PCR检测为阴性,则判为阴性。3.1.3类中和试验将10倍稀释的可疑阳性样本与不同浓度的猪乙脑病毒IgG抗体等体积混合,37℃孵育1h后接种至BHK-21细胞,乙脑病毒中山株(Nakayama)为阳性对照,MEM液为空白对照。37℃,5% CO2培养箱中培养7天,每天记录细胞病变情况,观察猪乙脑病毒IgG抗体对可疑病毒的保护作用。3.1.4可疑病毒增殖将经上述筛选过程判断为可疑乙脑病毒阳性标本(JH12、JH33、HK121、 HK151、HK212)过滤后染毒BHK-21细胞,盲传三代,进行细胞增殖。将细胞增殖病变液反复冻融3次,离心,过滤取上清液,和阳性对照(Nakayama株病毒液)、阴性对照(MEM液)一起,颅内各接种一窝3日龄NIH乳鼠进行病毒增殖,持续观察2周。接种24h内每2h观察1次,24h后每天观察3次。解剖濒死小鼠,取部分脑组织于RNA late r保存,用于TaqMan Real-time PCR检测乙脑病毒,另一部分脑组织用10%甲醛溶液固定后,制作病理切片,镜下观察病变情况。观察期内若无症状出现,则连续盲传三代,如仍未出现发病症状,且经TaqMan Real-time PCR检测后为阴性,则判断为阴性。3.1.5 TaqMan Real-time PCR检测可疑阳性样本用Roche High Pure viral RNA kit提取可疑阳性样本中的病毒RNA,再用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成相应的cDNA,以逆转录产物cDNA为模板,用TaqMan Real-time PCR法检测乙脑病毒(先制作标准曲线)。3.1.6 TaqMan Real-time PCR检测所有猪血清样本当上述流程未成功筛选分离出乙脑病毒时,为避免中间环节可能出现的差错,对所有猪血清样本,统一提取RNA,逆转录合成cDNA,再进行Real-time RT-PC R检测。3.2猪血清乙脑病毒IgG抗体检测为保证研究进度,在猪JEV IgG抗体ELISA试剂盒评价尚未完成之前,结合部分实验结果、厂家信誉、市场占有率和价格进行评估,选用Keqian猪JEV IgG抗体ELISA试剂盒,检测全部465份猪血清样本的JEV IgG抗体阳性情况。4.质量控制实验设计、准备和实施的过程中,同时开展严格的质量控制工作,遵守实验室安全守则,以保证实验科学、安全和顺利进行。研究结果1.猪血清样本于2013年1月至8月期间,赴广东省、海南省和江西省部分地区的屠宰场或肉联厂收集当地6-8月龄表观健康、未行乙脑疫苗免疫的家猪的血清样本共465份。2.猪乙脑病毒IgG抗体诊断试剂盒评价2.1三种ELISA试剂盒检测猪血清乙脑病毒IgG抗体的结果对90份猪血清标本进行检测,微量中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian、Lvshiyuan和Tianchen日性检出率分别为50.0%(45/90)、47.8%(43/90)和38.9%(35/90)。与微量中和试验比较,灵敏度最高的是Keqia n,为90.32%,其特异度为71.19%,Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%,Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别为41.94%和16.95%。与微量中和试验比较,Tianchen的K系数最高,为0.63；其次是Keqian,为0.57;Lvshiyuan仅为0.04。三种试剂盒同一批次检测结果重复性高,即均有较高的批次内稳定性。3.猪乙脑病毒感染率3.1猪血清乙脑病毒检测情况用上海瓦兰生物有限公司生产的商用猪血清JEV-Ag ELISA试剂盒初筛465份猪血清样本,共得到43份JEV抗原阳性样本,阳性率9.25%。阳性标本接种BHK-21细胞,24份染毒的细胞与阴性对照无明显区别,19份样本在接种第2天时开始陆续出现明显的细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等形态改变,部分呈菌落状聚集病变。将出现病变的19份样本过滤,重新染毒BHK-21细胞,三代盲传,得到11份有持续致病变能力的可疑样本。将11份可疑样本与购买的乙脑病毒抗体一同进行类中和试验,有5份样本能够被乙脑病毒抗体保护,分别命名为JH12、JH33、HK121、HK151和HK212。这5份可疑乙脑病毒阳性血清标本接种乳鼠,乳鼠均于接种后20-30h内死亡,接种同一样本的同一窝乳鼠死亡时间差不超过3h,乳鼠死亡时无明显特征反应。但是,所有样本用TaqMan Real-time PCR检测均为乙脑病毒阴性。鉴于以上流程未成功分离到乙脑病毒,为避免中间环节可能出现的差错,将所有猪血清样本统一提取RNA进行Real-time PCR检测,部分血清量不够用于提取RNA的样本(<200μ1)未纳入检测。合计检测437份猪血清样本乙脑病毒特异性核酸,Real-time PCR检测未发现阳性结果。3.2猪血清乙脑病毒IgG抗体检测结果ELISA方法(Keqian,生产批号为131005)检测465份猪血清样本,JEV IgG抗体检出率高达95.7%,其中7、8月采集的猪血清样本的检出率近乎100%。不同生产批号(130101和131005)试剂盒检测的阳性率差异有统计学意义(χ2=26.04,P<0.001),K系数等于0.378。研究结论1.目前国内商品化猪JEV IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大；与微量中和试验相比,存在较高的假阳性率。说明试剂盒质量有待提高。2.对广东省、海南省和江西省当地6-8月龄表观健康、未行乙脑疫苗免疫的家猪的血清样本进行乙脑病毒携带检测,乙脑病毒阳性率为9.25%,但未检测到乙脑病毒核酸,也未分离到乙脑病毒株；乙脑病毒IgG抗体阳性率高达95.7%。结果提示广东、海南和江西成年家猪中乙脑病毒感染高,应引起高度重视。