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第一部分:HBV相关性肝癌关键节点基因的生物信息学分析目的和意义对GEO数据库中的乙肝病毒相关性肝细胞癌（HBV-related Hepatocellular Carcinoma,HBV-HCC）进行生物信息学分析,旨在筛选在HBV相关性肝癌中发挥作用的关键基因,以期寻找到肝细胞癌相关的肿瘤分子标志物和药物治疗靶点,为肝癌的早期诊断和早期治疗提供理论依据。方法1、从GEO数据库以“Liver Cancer”或“HCC”或“Hepatocellular Carcinoma”以及“HBV”或“Hepatitis B Virus”来搜索相关数据集,筛选HBV相关性肝细胞癌症相关数据集并下载。2、使用R语言对表达谱数据集进行标准化处理并分别提取每个数据集的差异表达基因（Differentially expression genes,DEGs）,利用RRA法联合所有DEGs进行整合排序,获得最终的DEGs。筛选标准为:P adjust＜0.05,|log2FC|＞1。3、利用DAVID在线分析平台对筛选出的DEGs进行GO基因功能注释和KEGG通路富集分析。4、利用STRING在线分析网站构建DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络。5、采用Cytoscape软件“Mcode”插件挖掘HBV-HCC中的主要疾病功能模块,选取排名前两位的疾病模块进行可视化,并对前两名疾病模块内的DEGs进行KEGG分析。6、采用Cytoscape软件“Hubba”插件挖掘蛋白质互作网络的关键节点基因筛选,综合连接中心度、中介中心度、接近中心度和最大团中心度4个参数排名,筛选出关键节点基因。7、利用GEPIA2数据库进一步验证关键节点基因的m RNA表达水平,及其与癌症分期、患者预后之间的关系。结果1、通过GEO数据库,共获得GSE121248,GSE19665,GSE47197和GSE55092等4个基因表达谱数据集,共包含185个HBV相关性肝细胞癌症组织样本和196个癌旁非肿瘤组织样本。2、RRA整合分析结果表明:4个数据集共鉴定出320个DEGs,其中包括104个上调DEGs和216个下调DEGs。3、GO功能注释分析表明:HBV-HCC中上调的DEGs主要在细胞周期和分解代谢、染色体和纺锤体、蛋白质结合和微管结合等生理过程中起作用。下调的DEGs主要在炎症反应和免疫反应;细胞外泌体和膜攻击复合体;血红素结合和铁离子结合等生理过程中发挥作用。4、KEGG富集分析结果表明:DEGs主要富集于代谢途径、p53信号通路、细胞周期等信号传导通路。5、MCODE插件共鉴定出14个主要疾病功能模块,模块1主要富集于细胞周期,p53信号通路等过程;模块2主要富集于补体和凝血级联,病毒疾病等过程。6、Hubba插件最终通过4个不同的参数鉴定出6个关键节点基因:CDK1,CCNB1,CDC20,CDKN3,HMMR和MKI67。7、在GEPIA2网站上对6个关键节点基因的m RNA验证结果显示:6个关键节点基因在肝细胞癌中的表达显著高于正常肝组织（P＜0.05）;CDK1（P＜0.001）、CDC20（P＜0.001）、CCNB1（P＜0.001）、CDKN3（P=0.004）、HMMR（P=0.001）和MKI67（P＜0.001）的m RNA表达水平与肝细胞癌不同分期之间呈正相关且有统计学意义。8、在GEPIA2网站上分析在GEPIA2网站上对6个关键节点基因的生存分析表明:CDK1（HR=1.7,Log Rank P=0.001）,CDC20（HR=1.6,Log Rank P=0.003）,HMMR（HR=1.6,Log Rank P=0.003）,CDKN3（HR=1.5,Log Rank P=0.007）和MKI67（HR=1.9,Log Rank P＜0.001）和CCNB1（HR=2,Log Rank P＜0.001）共6个关键节点基因的高表达与肝细胞癌患者的无病生存期有关,且有统计学意义。CDK1（HR=2,Log Rank P＜0.001）,CDC20（HR=2.3,Log Rank P＜0.001）,HMMR（HR=1.7,Log Rank P=0.003）,MKI67（HR=1.9,Log Rank P＜0.001）和CCNB1（HR=2,Log Rank P＜0.001）等5个关键节点基因的高表达与肝细胞癌患者总生存率相关,且具有统计学意义;尚不能认为CDKN3的表达水平与肝细胞癌患者的总生存率相关（HR=1.4,Log Rank P=0.058）。结论1、细胞有丝分裂、细胞周期调控与HBV相关性肝细胞癌的发生和演进过程密切相关。其中关键节点基因CDK1,CCNB1,CDC20,CDKN3,HMMR和MKI67在HBV-HCC的进程中扮演着重要角色。2、6个关键节点基因CDK1,CCNB1,CDC20,CDKN3,HMMR和MKI67在肝细胞癌中m RNA表达水平上调,且与HCC患者无病生存期相关。CDK1,CCNB1,CDC20,HMMR和MKI67的表达水平与HCC患者总生存期相关。第二部分:CCNB1等关键基因的表达及其与HBV相关肝癌预后的关联分析目的和意义检测CCNB1、CDK1、CDC20、CDKN3、HMMR、MKI67、HBX、CDC25c、P53等蛋白在HBV相关性肝细胞癌（HBV-related Hepatocellular Carcinoma,HBV-HCC）组织中的表达水平,探讨其与HBV-HCC患者的临床病理和预后的关系。方法1、以2013年11月至2014年11月期间在广西医科大学附属肿瘤医院接受肝切除术的HBV-HCC患者69例及非HBV-HCC患者6例为研究对象,采集其肝癌组织及其对应的癌旁组织、癌周正常肝组织蜡块标本,构建159位点的组织芯片。收集患者临床病理资料和随访资料。2、免疫组化方法检测CCNB1、CDK1、CDC20、CDKN3、HMMR、MKI67、HBX、CDC25c、P53等9个基因所编码的蛋白表达情况。并统计分析上述蛋白的表达与HBV-HCC患者临床病理参数的相关性。3、Kaplan-Meier法探究9个关键基因表达与HBV-HCC总体生存率之间的关系。4、分析9个关键基因在HCC相关肝组织中的表达与HBV感染之间的联系。5、采Spearman秩相关分析HBX与其他关键基因表达之间的相关性。6、基于COX比例风险模型,运用单因素和多因素分析筛选HBV-HCC患者生存相关的独立预后因素,并构建预测得分模型。7、采用R语言Survival ROC软件包,绘制预测得分模型第1、3、5年的时间依赖性ROC曲线,从而了解其评估能力。结果1、免疫组化染色结果表明,CCNB1、CDK1、CDC20、CDKN3、HMMR、MKI67、HBX、CDC25c、P53等9个关键基因在HBV-HCC中均有表达。在HBV-HCC肝癌组织中,CCNB1和CDK1的表达较癌旁组织上调,HMMR、CDC20和CDC25c的表达较癌旁组织下调,差异有统计学意义（P＜0.05）。2、在HBV-HCC患者中,CDK1的表达与CA199水平（P=0.003）,淋巴结转移（P=0.044）有关;CCNB1的表达与B细胞（P=0.046）有关;CDC20的表达与性别（P=0.042）、肝癌分化程度（P=0.005）有关;CDKN3的表达与B细胞（P=0.020）有关;HMMR的表达与AFP水平（P=0.040）、CEA水平（P=0.005）、肿瘤数量（P=0.018）有关;MKI67的表达与分化程度（P=0.034）有关;CDC25c的表达与年龄（P=0.004）、AFP水平（P=0.045）有关;HBX的表达与CEA水平（P=0.010）、微血管血栓（P=0.007）有关。3、不同HBV感染情况下,HMMR（P=0.041）、CDKN3（P=0.028）、HBX（P＜0.001）在肝癌组织中表达不同;HMMR（P=0.050）、HBX（P＜0.001）在癌旁组织中表达不同;HBX（P＜0.001）在癌周正常肝组织中的表达不同,差异均有统计学意义。4、P53的低表达与HBV-HCC患者预后不良有关（P=0.015）。5、CDK1,CCNB1,CDC20,CDKN3,HMMR,MKI67,P53和CDC25c与HBX呈正相关,且均具有统计学意义（P＜0.05）。6、BCLC分期、P53是HBV-HCC的生存预后因素;P53、BCLC分期、HBV-DNA、肿瘤包膜、总胆红素是HBV-HCC生存相关的独立预后因素,并以此构建HBV-HCC预后得分模型。7、以P53、BCLC分期、HBV-DNA、肿瘤包膜、总胆红素建立的预后得分模型能够较准确的预测HBV-HCC患者术后第3、5年的预后情况。结论1、CCNB1、CDK1、HMMR、CDC20、CDC25c可能与HBV-HCC的发生发展有关,并可作为肝癌分子治疗的潜在靶点;2、P53的表达与HBV-HCC患者总生存期相关;3、HBX与8个关键基因的表达呈正相关。HBV感染可能通过某些途径影响关键基因的表达,介导细胞周期通路（尤其是G2/M期）、DNA损伤修复和P53传导通路的调控,从而参与HBV-HCC的演变进程;4、BCLC分期、P53是HBV-HCC的生存预后因素;P53、BCLC分期、HBV-DNA、肿瘤包膜、总胆红素水平是HBV-HCC影响患者生存的独立预后因素。5、以P53、BCLC分期、HBV-DNA、肿瘤包膜、总胆红素建立的预后得分模型能够较准确的预测HBV-HCC患者术后第3、5年的预后情况,可能为HBV-HCC患者的诊断、疗效评估、治疗监测、预后判断提供新指标、新思路、新策略。