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木质纤维素生物质资源是自然界中最主要的可再生资源,同时也是生物燃料及生物炼制所需的最具潜力的原料。然而,木质纤维素的难降解特性是阻碍这些可再生资源有效利用的关键因素。丝状真菌表达的纤维素酶能高效降解木质纤维素,并且其高效表达纤维素酶的特性是解决这一难题的有利条件。草酸青霉(Penicillium oxalicum)是本实验室从土壤中筛选得到的一株高产纤维素酶的丝状真菌。由于纤维素酶在生物质的降解利用过程中用量巨大,因此,有必要通过理性改造的方法进一步提高现有工业菌株的纤维素酶表达水平。草酸青霉的多靶点遗传操作是菌株理性构建的关键所在。因此,如何突破草酸青霉的遗传筛选标记限制,建立适用其连续和多基因大片段操作的技术方法是目前急需解决的关键问题。本论文的主要研究结果如下:一、利用Red/ET重组系统构建多纤维素酶基因大片段表达盒Red/ET重组是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rac噬菌体RecE/RecT重组系统的DNA工程技术。Red/ET重组技术能够高效地将多个基因大片段重组在一起,由于基因片段的扩增长度受PCR技术的限制,利用Red/ET重组技术可有效突破这一技术限制,构建携带有多个纤维素酶相关基因的大片段,从而提高基因转化的效率,即一次转化即可对多种纤维素酶相关基因进行遗传操作,进而有利于草酸青霉高产纤维素酶菌株的构建。本次工作,设计了一个长达15kb的多纤维素酶基因表达盒,将该表达盒转化草酸青霉114-2,滤纸酶活(FPA)最高时较出发菌株提高了 60多倍,达到了较为理想的效果。该技术的成功应用,不仅节省了标记基因的使用,同时为草酸青霉高产纤维素酶菌株的构建工作提供了一种快速有效的技术方法。二、构建β-Rec/six筛选标记重复利用系统在丝状真菌构建高产纤维素酶菌株的过程中,基因的敲除及过表达往往依赖于标记基因的筛选。目前,有限数量的筛选标记限制了菌株遗传操作的次数。一些抗生素抗性基因作为筛选标记也不利于表达宿主细胞的安全应用,并有可能对环境产生不良影响。因此,如何突破丝状真菌可用遗传筛选标记的限制,建立多基因操作的技术平台是当前需要解决的重要问题。β-Rec/six自删除系统是基于细菌β-Rec丝氨酸重组酶,该重组酶能够识别同一 DNA分子内的两个相邻的six位点,并特异性的剪切掉位于两个相邻six序列之间的片段。在本论文研究中,我们利用来源于构巢曲霉的pyrG基因作为遗传操作的筛选标记,在草酸青霉尿嘧啶缺陷型菌株M12中,成功实现了该筛选标记的循环利用,并得到了一株可用于筛选标记重复利用的且酶活性能良好的菌株RDB7-1-1。本论文中的这一研究结果,突破了草酸青霉遗传操作筛选标记的局限性。三、利用Red/ET重组系统及p-Rec/six筛选标记重复利用系统构建高产内切纤维素酶及木聚糖酶菌株在前期工作的基础上,我们建立起了适用草酸青霉连续和多基因大片段操作的技术方法,接下来,将结合使用Red/ET重组系统及β3-Rec/six自删除系统,构建高产内切纤维素酶菌株及木聚糖酶菌株。本次研究设计了三个大片段基因表达盒,包括两个内切纤维素酶基因表达盒EEC及EXDC,将该两个表达盒分别转化筛选标记重复利用菌株RDB7-1-1,从而得到REEC及REX菌株;还包括一个木聚糖酶基因表达盒XXC,用来转化REX菌株,得到XXC菌株。得到的转化子都实现了筛选标记的重复利用,酶活也得到了一定的提高,其中REX菌株酶活提高较为理想,内切纤维素酶活提高了 1.5倍,木聚糖酶活提高13倍;XXC菌株滤纸酶活提高5倍,木聚糖酶活提高2倍。以上实验结果表明,结合使用Red/ET重组系统及β-Rec/six自删除系统可以很好的用来构建高产纤维素酶及半纤维素酶菌株,只是目前得到的重组菌株的产酶表现还没有达到期望的水平,未来的工作需要继续探索改进重组酶表达效果的策略。