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莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是中国用量较大的一种水生蔬菜,药食两用,其整个植株十个部位中有六个部位入药。莲藕具有很高的食用价值和药用价值,多酚氧化酶是植物中广泛存在的抗氧化酶,它同时也是导致莲藕等果蔬农产品采后褐变的重要原因。课题组前期通过酵母双杂的方法筛选出莲藕多酚氧化酶(Nn PPO1)与金鱼草素合成酶(Nn AUS)、半胱氨酸脱硫酶(Nn Cys)之间存在蛋白互作,但互作模式并不清楚,在此基础上,本研究进一步筛选、验证莲藕Nn PPO1与何蛋白互作,并明确它们的组织特异性表达和亚细胞定位,逐步探索Nn PPO1在莲藕中的作用机制,为精准抑制其活性奠定基础,对于采后控制莲藕褐变、延长其产业链具有重要意义。主要试验结果如下:1.本试验将抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、半胱氨酸过氧化物酶、过氧化物酶等酶的基因序列,分别连接至p GADT7载体上,与课题组前期构建的JDPPO1-BD载体(Nn PPO1去除N端导肽部分所构载体)共转化酵母,以筛选互作蛋白,结果表明Nn PPO1与Nn CAT1之间存在互作关系,经过自激活和毒性试验表明,Nn CAT1对酵母系统没有自激活作用且对酵母无毒性。2.将Nn PPO1与Nn AUS、Nn Cys、Nn CAT1的CDS区分别连接至Bi FC载体35S-SPYNE(R)173与35S-SPYCE(M)上,转化烟草后在共聚焦显微镜下观察荧光信号,结果显示Nn PPO1与Nn CAT1在细胞膜和细胞核上有强烈的互作,Nn PPO1与Nn Cys在细胞膜上存在互作,Nn PPO1与Nn AUS之间存在微弱的互作,互作位置为细胞膜和细胞核。3.将Nn PPO1进行了结构域的截短,以酪氨酸酶结构域、PPO1＿KFDV结构域、PPO1＿DWL结构域构建了三个猎物载体,分别与Nn AUS-AD、Nn Cys-AD、Nn CAT1-AD载体共转化酵母,Y2H试验发现Nn PPO1与Nn AUS、Nn Cys、Nn CAT1的互作部位都在保守结构域酪氨酸酶结构域。对Nn AUS、Nn Cys、Nn CAT1以各自的结构域分别截短构建诱饵载体与JDPPO1-BD共转化酵母,结果表明Nn AUS发挥互作的部位也是酪氨酸酶结构域,Nn Cys、Nn CAT1截短后与JDPPO1-BD不在发生蛋白互作。对Nn PPO1和Nn AUS的酪氨酸酶结构域进行再截短构建一系列载体,以找到互作特异性功能位点,结果表明Nn PPO1与Nn AUS、Nn CAT1蛋白互作,主要是Nn PPO1蛋白序列上的N-糖基化位点和N-肉豆蔻酰化位点发挥蛋白互作作用,Nn AUS与Nn PPO1发生互作的功能位点是其Cu A结构域及其前30 aa部分,而AD-Nn Cys与Nn PPO1的截短酪氨酸酶结构域所构建的系列载体都发生互作。4.亚细胞定位发现,Nn AUS和Nn CAT1定位于细胞核和细胞膜上,Nn Cys蛋白定位于细胞膜、细胞核以及细胞质上;组织特异性表达结果显示,Nn PPO1、Nn AUS、Nn Cys、Nn CAT1在莲藕幼苗的不同组织中四个基因均有表达,Nn PPO1、Nn CAT1、Nn Cys三者的表达模式基本相同,都在叶内的表达量最多,在茎尖中表达量最低。Nn AUS在根中的表达量最高,在叶和藕带中有少量的表达,在叶柄和茎尖中只有微量的表达。通过对Nn AUS、Nn CAT1、Nn Cys的理化性质、启动子和二三级结构等分析表明,这些蛋白在功能和结构方面与Nn PPO1有很多相似。