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β-地中海贫血症是一种典型的溶血性遗传贫血症,在我国长江以南各省具有较高的发病率。“输血+铁螯合治疗”是目前重型β-地中海贫血症的主要治疗手段。由于我国尚无自主知识产权的去铁药物或仿制药,该类药物只能依赖于进口,导致药价居高不下,相关药物的研发迫在眉睫。DP-01是优秀的候选铁螯合剂,具有良好的研发前景。鉴于其在体内的吸收、转运、代谢和排泄等过程还不甚明确,本文旨在通过体外细胞模型和动物实验,对DP-01的吸收、排泄及转运过程进行研究,为后期研发提供参考。1.DP-01在Caco-2细胞模型中的转运研究目的:利用Caco-2细胞模型研究DP-01在小肠上皮细胞中的吸收情况。方法:以Caco-2细胞为模型,应用HBSS中DP-01测定的HPLC方法,研究DP-01的双向转运机制,考察时间、浓度及pH值对DP-01转运的影响,计算DP-01的表观渗透系数Papp值和外排比率。结果:在 pH 7.4,DP-01 浓度为 50,200,500 μmol/L 时,其 AP→BL 的 Papp 值分别为 6.40～8.17×10-6 cm/s(P>0.05),BL→AP 的 Papp 值分别为 8.21～8.40×10-6 cm/s(P>0.05);外排比率分别为1.3,1.1,1.0。同时发现,DP-01在pH 6.5附近(pH 5.0～7.4间)具有最大的Papp值(P<0.05)。结论:DP-01主要以被动扩散方式被小肠上皮细胞摄取并实现跨膜转运,其渗透性较好,在pH 6.5附近(pH 5.0～7.4间)具有最佳吸收。2.大鼠单次灌胃DP-01后的尿液排泄研究目的:建立大鼠尿液中DP-01浓度测定的HPLC分析方法,研究大鼠单次灌胃给药DP-01后尿液中的排泄情况。方法:通过比对大鼠灌胃给药前后的尿液液相色谱图、酶解前后测得的DP-01含量,考察尿液中DP-01的原型及可能的主要代谢物。大鼠单次灌胃44.3 mg/kg DP-01盐酸盐后,分段收集尿液至84 h,应用本研究建立的大鼠尿液中DP-01的HPLC定量分析方法,测定尿液中DP-01的浓度。根据浓度和尿液体积,计算尿液中DP-01累积排泄率。结果:与空白尿液及对照品溶液色谱图比对发现,大鼠灌胃DP-01后的尿液样品,在DP-01保留时间处存在色谱峰;酶解后的DP-01峰面积未见明显增加。建立了大鼠尿液中DP-01测定的HPLC方法。尿液中DP-01在0.5～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好;定量下限为0.5μg/mL(RSD<3.53%);方法回收率在96.5～100.8%之间;DP-01及内标DP-36的提取回收率分别为86.3～87.0%和86.1%;批间及批内精密度RSD均小于2.1%。各项稳定性均符合要求。给药后0～84h内尿液中的累积排泄量相当于给药总量的57.53±9.2%(n=6)。结论:大鼠灌胃DP-01后,尿液中主要以原型排泄;本研究建立的HPLC分析方法可用于大鼠尿液中DP-01的定量分析;大鼠单次灌胃44.3 mg/kg DP-01后,其原型药物累计排泄率为57.53±9.2%(n=6)。3.DP-01与细胞膜转运体hOCTs及hOAT1体外相互作用研究目的:考察DP-01与人有机阳离子转运体hOCT1、hOCT2、hOCT3及有机阴离子转运体hOAT1的相互作用。方法:应用稳定表达hOCTs及hOAT1的细胞模型考察DP-01对经典底物(hOCTs:MPP+;hOAT1:6-CF)在细胞内积聚的影响;比较DP-01在mock细胞及MDCK-hOCTs、MDCK-hOAT1中积聚的差异,以及各转运体相应的抑制剂对DP-01细胞积聚的影响。结果:在 MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3 细胞中,100 μmol/LDP-01使MPP+积聚量分别减少至阴性对照的60.7%、95.3%和67.5%;300 μmol/L DP-01浓度下MPP+积聚量分别约为阴性对照的41.8%、71.7%和63.3%。100 μmol/L和300 μmol/L的DP-01分别使6-CF积聚量降低至阴性对照的47.2%和60.5%。DP-01在MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT3、MDCK-hOAT1细胞内的积聚量均显著高于mock细胞,其中在MDCK-hOCT1、MDCK-hOAT1细胞内,DP-01的积聚量均大于mock细胞积聚量的2倍,且经典抑制剂可使稳转细胞模型中DP-01的积聚量明显降低。DP-01在MDCK-hOCT2与MDCK-mock细胞内的积聚相近,且经典抑制剂对DP-01在细胞内的积聚亦未显示明显影响。结论:DP-01对hOCTs和hOAT1均存在一定的抑制作用;且DP-01为hOCT1和hOAT1的转运底物。