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壳聚糖酶是一种糖苷水解酶,可催化β-1,4糖苷键的水解,可用来转化甲壳类生物废物以及壳寡糖制备等,在食品工程和生物技术等领域具有重要应用价值。但是目前发现的大部分壳聚糖酶的热稳定较差,活力低,这限制了其在工业生产中的应用。本研究从海洋基因文库中筛选到14个壳聚糖酶基因,并对两个酶活较高的壳聚糖酶CHIS5和CHIS1754进行了性质测定,并通过理性分子设计对CHIS1754进行了多点突变,成功提高了热稳定性。主要结果如下:1.从海洋基因文库中筛选到14个壳聚糖酶基因,通过酶切位点EcoR Ⅰ和NotⅠ将其构建在pET30a表达载体上并在大肠杆菌中成功表达。通过酶活测定从中筛选到两个酶活较高的壳聚糖酶CHIS5和CHIS1754,并对两个蛋白进行了纯化,通过SDS-PAGE分析确定两个蛋白的分子量大小约为35 kD和25 kD。2.通过测定壳聚糖酶对不同脱乙酰度底物的作用效果,发现壳聚糖酶对脱乙酰度越高的底物表现出更高的活性。对壳聚糖酶的理化性质进行了研究,重组壳聚糖酶CHIS5在60℃和pH 5.5时具有最佳活性,CHIS1754的最适温度为55℃最适pH为5.5。其中CHIS1754的热稳定性优于CHIS5,在60℃下保温20 min后有40%的剩余酶活,之后热稳定性迅速降低。测定了金属离子对两个壳聚糖酶的影响,发现Cu2+和Fe2+对两个酶有明显的抑制作用,Fe2+抑制作用最明显。3.测定了两个酶的动力学参数,CHIS5的Km,kcat和Vmax值分别为4.19 mg·mL-1、19.64 min-1 和9.42 μM·min-1 mL-1,效率常数kcat/Km为4.69mL·mg-1 min-1;CHIS1754的Km,kat和Vmax值分别为5.28 mg·mL-1、41.06 min-1和90.-33 μM·min-1mL-1,效率常数kcat/Km为7.78 mL·mg-1 min-1。4.通过TLC和LC-QTOF-MS分析了壳聚糖酶的作用方式,发现两个壳聚糖酶均为内切型壳聚糖酶,生成的壳寡糖产物主要是二糖和三糖。5.通过理性设计对chis1 754基因进行了 15个点的多点突变,突变后的壳聚糖酶CHIS1754T最适温度提高了5℃,Tm值提高了7.63℃,在60℃下保持1小时的残留酶活性仍高达80%。同时,CHIS1754T的kcat/Km比CHIS1754的kcat/Km增加了约4.8倍。酶活提高了两倍左右。6.将壳聚糖酶于酵母中进行表达,观察了其在摇瓶水平的酶活表达情况。其中CHIS5的酶活能达到9.0 U/mL,CHIS1754能达到6.5 U/mL,CHIS1754T酶活能达到酶活为9.9 U/mL。本研究从海洋文库中筛选到壳聚糖酶基因,并在大肠杆菌和酵母中成功表达,通过理性设计方法成功提高了壳聚糖酶的热稳定性和催化活性,为该酶在食品工业和生物技术产业中的应用奠定了良好基础。