MTB-1806(5-bromo-2-(5-fluoro-1-hydroxyamyl)benzoate calcium,5-溴-2-(5-氟-1-羟戊基)苯甲酸钙)是在丁苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)的化学结构基础上经过结构修饰遴选出来的新型化合物,NBP临床上主要用于治疗缺血性脑卒中,并获得了良好的治疗效果。本研究通过在体实验证明MTB-1806对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其部分机制可能与抑制P38 MAPK的表达,增加自噬相关因子Beclin-1,LC3的水平有关;通过构建大鼠卒中后抑郁(PSD)模型,进一步证明MTB-1806能够改善PSD大鼠脑内去甲肾上腺素(NA),多巴胺(DA),5-羟色胺(5-HT)和乙酰胆碱(ACh)的水平,进而改善大鼠的认知障碍和精神状态;并通过过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)损伤模型证明了 MTB-1806对神经细胞有保护作用。第Ⅰ部分MTB-1806对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目的:研究MTB-1806对大鼠短暂性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制方法:实验一:将100只SD雄性大鼠随机分为10组,每组10只:假手术组,模型组,NBP 4.67 mg/kg 组,MTB-1806 组(1.25,1.58,2.58,3.68,5.25,7.95,10.70 mg/kg)。MTB-1806 7.95 mg/kg 和 NBP 4.67 mg/kg 为等摩尔剂量。采用改良的Zea-longa线栓法建立MCAO模型,缺血2h再灌注24h,术前0.5h灌胃给予MTB-1806和NBP,MTB-1806和NBP分别用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解,假手术组和模型组灌胃等体积的0.5%CMC-Na。再灌24h后将大鼠断头取脑,进行组织处理和其它测定。实验二:将70只雄性SD大鼠随机分为7组,每组10只。即假手术组,模型组,NBP 4.67 mg/kg 组,SB-203580 5mg/kg 组,MTB-1806 组(1.58,5.25,7.95 mg/kg)。MTB-1806 7.95 mg/kg 和 NBP4.67 mg/kg 为等摩尔剂量。术前 0.5h灌胃给予相应剂量的MTB-1806,NBP和SB-203580。MTB-1806组和NBP组用0.5%CMC-Na溶解。SB-203580组用1%DMSO溶解。假手术组和模型组通过灌胃给予等体积的0.5%CMC-Na。MCAO后26h将所有大鼠断头,透射电子显微电镜下观察自噬小体,HE染色观察坏死神经元的比例,免疫组化法检测P38 MAPK,Beclin-1 和 LC3 的表达,WB 定量 Beclin-1 和 LC3 蛋白。结果:1.神经行为学评分变化:与假手术组相比,模型组出现神经行为缺失,例如对侧肩旋转和前肢内收,无力,行走绕圈等行为障碍。模型组的神经行为评分为3.30±0.48(P<0.01)。与模型组相比,MTB-1806(5.25,7.95,10.70 mg/kg)组剂量依赖性地改善神经运动功能障碍,评分分别为2.00±0.67,1.50±0.53和1.30±0.48(P<0.05,P<0.01)。等摩尔剂量的 MTB-1806 7.95 mg/kg 组(1.50±0.53)效果优于 NBP 组(2.60±0.52)(P<0.01)。ED 50=7.71 mg/kg。2.梗死体积的变化:与模型组相比,MTB-1806(1.58,2.58,3.68,5.25,7.95,10.70 mg/kg)组以剂量依赖性方式显着降低了脑梗死体积,抑制率分别为:9.05%,25.77%,34.00%,46.59%,59.15%,78.14%,77.81%(P<0.05,P<0.01)。等摩尔剂量的MTB-1806 7.95 mg/kg组[(10.60±1.30)%]效果优于NBP组[(37.50±1.6)%](P<0.01)。结果表明,MTB-1806 7.95 mg/kg 组和 MTB-180610.70 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。即MTB-1806 7.95 mg/kg为最大有效量。ED50=3.85 mg/kg。3.脑肿胀体积变化:与模型组相比,MTB-1806(1.58,2.58,3.68,5.25,7.95,10.70mg/kg)以剂量依赖性显著降低脑肿胀体积(P<0.05,P<0.01),等摩尔剂量的 MTB-1806 7.95mg/kg组[(2.84±0.87)%]效果优于NBP 组[(15.29±2.12)%](P<0.01)。ED50=3.63 mg/kg。4.HE染色的形态变化:假手术组的皮层,海马和纹状体组织结构清晰,细胞排列致密,整齐,无水肿,核居中,核仁清晰。与假手术组相比,模型组半暗带处可见明显的形态学变化:神经元细胞丢失,细胞核皱缩和神经元暗染(P<0.01)等。与模型组相比,MTB-1806(5.25,7.95 mg/kg)可显著减少皮质神经元坏死[(42.5±7.8)%,(13.7±4.6)%](P<0.05,P<0.01);海马神经元坏死[(26±5.1)%,(10.2±8.5)%](P<0.01)和纹状体神经元坏死[(26.4±4.9)%,(11.3±3.8)%](P<0.05,P<0.01)。且等摩尔剂量 MTB-1806 7.95 mg/kg 组效果优于 NBP 组(P<0.05)。结果表明,MTB-1806 7.95 mg/kg 组和 SB-203580 5 mg/kg 组之间无统计学差异(P>0.05)。5.自噬小体数量变化:在假手术组的海马和皮层中,能够观察到少量自噬体,MCAO模型再灌注24小时之后,观察到自噬体数量有所增加,MTB-1806,NBP和SB-203580治疗后,电镜下单位面积中自噬体数量比模型组进一步增多,并且等摩尔剂量的 MTB-1806 组多于 NBP 组,MTB-1806 10.70 mg/kg 组与 SB-203580组相比无统计学差异(P>0.05)。6.自噬相关因子变化:阳性细胞数和光密度显示,与模型组相比,MTB-1806(1.58,5.25,7.95 mg/kg),SB-203580(5 mg/kg)和 NBP(4.67 mg/kg)显着降低皮层,海马和纹状体中P38 MAPK的表达(P<0.05,P<0.01),分别增加皮层,海马和纹状体中Beclin-1和LC3的表达(P<0.05,P<0.01),而等摩尔剂量 MTB-1806 7.95 mg/kg 组效果优于 NBP 组(P<0.05,P<0.01),但是 MTB-18067.95 mg/kg组和SB-203580组无统计学意义(P>0.05)。结果表明,MTB-1806能够抑制P38 MAPK的表达并增加Beclin-1和LC3的表达。7.自噬相关蛋白的变化:与模型组相比,MTB-1806(5.25,7.95 mg/kg)组,SB-203580 5 mg/kg组,显著增加LC3蛋白表达水平(P<0.05),且等摩尔剂量MTB-1806 7.95mg/kg 组效果优于 NBP 组,MTB-1806(5.25,7.95 mg/kg)组和SB-203580组相比,无统计学差异;与模型组相比,MTB-1806(7.95 mg/kg)组显著增加Beclin-1蛋白表达水平(P<0.01),等摩尔剂量MTB-1806组效果优于NBP 组。结论:MTB-1806对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,可以显着改善MCAO模型神经功能缺损,减少脑梗死体积,脑肿胀体积和神经元细胞丢失,其部分作用机制可能是通过抑制P38 MAPK的表达和增加自噬水平有关。第Ⅱ部分 MTB-1806改善MCAO诱导的抑郁症大鼠的行为变化和单胺类递质水平目的:探讨MTB-1806对卒中后抑郁大鼠(PSD)的行为变化和单胺类神经递质的影响方法:1.模型建立 MCAO模型+慢性不可预见温和应激(CUMS)+孤养,建立卒中后抑郁(PSD)大鼠模型CUMS:按willner和Katz方法略改进,①倾斜鼠笼过夜,②同时禁食禁水过夜,③仅仅禁水过夜,④灯光照射过夜,⑤潮湿环境过夜,⑥异物放置(木片/塑料片),⑦异物刺激(新鲜空气除臭剂),⑧行为限制2 h。共8种刺激每天随机采取一种,持续21天。孤养:各组动物单笼饲养。2.分组和给药:将雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组,模型组,抑郁组,抑郁组+NBP 组,抑郁组+MTB-1806 组,PSD 组,PSD+NBP 组,PSD+MTB-1806组,每组6只。其中MTB-1806 7.95 mg/kg和NBP 4.67 mg/kg为等摩尔剂量。造模3周后,给药组给药3周,取脑检测各项指标。3.观察指标:应激前和每周进行体重,蔗糖消耗比例,水平和垂直得分测定,ELISA试剂盒检测脑组织去甲肾上腺素(Noradrenaline,NA),多巴胺(Dopamine,DA),5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)的含量变化。结果:1.MTB-1806改善MCAO诱发抑郁大鼠的行为变化:在CUMS之前,不同组大鼠的体重和蔗糖消耗比例无统计学差异(P>0.05)。CUMS术后3周,MCAO组和PSD组的体重和蔗糖消耗率均明显低于假手术组(P<0.01),但与假手术组相比,抑郁组无统计学意义(P>0.05)。给予MTB-1806(7.95 mg/kg)后,抑郁组和PSD组动物的体重和蔗糖消耗率显着增加(P<0.05,P<0.01)。MTB-18067.95 mg/kg组和NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。在CUMS之前,不同组大鼠水平和垂直运动活动评分无统计学差异(P>0.05)。CUMS术后3周,MCAO组,PSD组和抑郁组水平和垂直运动评分均低于假手术组(P<0.05,P<0.01)。给予MTB-1806(7.95 mg/kg)后抑郁组和PSD组水平和垂直得分明显增加(P<0.05,P<0.01)。等摩尔剂量MTB-1806 7.95 mg/kg组和NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。2.MTB-1806升高MCAO诱发的抑郁症大鼠的单胺类水平2.1 DA含量的变化:与假手术组相比,MCAO组(8.9±1.8 ng/mg,P<0.01),抑郁症组(11.2±1.4 ng/mg,P<0.05)和 PSD 组(7.6±1.1 ng/mg,P<0.01)的DA水平明显低于假手术组(19.1±2.7ng/mg)。与抑郁症组相比,给予等摩尔剂量的MTB-1806或者NBP,大鼠脑内的DA水平无统计学意义(P>0.05)。与PSD组相比,给予MTB-1806 7.95 mg/kg和NBP 4.67 mg/kg治疗后,大鼠脑内DA 水平显著增加,分别为:13.4±1.7 ng/mg,12.5± 1.2 ng/mg(P<0.05,P<0.01),但是MTB-1806 7.95 mg/kg组与NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。2.2 NA含量的变化:与假手术组相比(28.7±3.2 ng/mg),NA水平在MCAO组(17.6±2.7 ng/mg,P<0.01),抑郁组(19.0±3.4 ng/mg,P<0.05)和 PSD 组(15.4±1.5 ng/mg,P<0.01)明显降低。与抑郁组相比,给予等摩尔剂量MTB-1806或者NBP,大鼠脑内NA水平无明显差异(P>0.05)。与PSD组相比,给与MTB-18067.95 mg/kg 和 NBP 4.67 mg/kg 治疗后均显著增加 NA 水平(22.6±3.3 ng/mg,20.2±4.5 ng/mg,P<0.05,P<0.01),但是,MTB-1806 7.95 mg/kg 组与 NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。2.3 ACh含量的变化:与假手术组相比,MCAO组(9.9±1.4 ng/mg,P<0.01),抑郁组(12.3±1.2 ng/mg,P<0.05)和PSD组(9.4±1.6 ng/mg,P<0.01)的ACh水平均明显低于假手术组(20.7±2.1 ng/mg)。与抑郁组相比,等摩尔剂量的MTB-1806或者NBP大鼠脑内的ACh水平无明显差异(P>0.05)。与PSD组相比,给与MTB-1806 7.95 mg/kg和NBP 4.67 mg/kg治疗后,大鼠脑内ACh水平显著升高(15.6±1.8 ng/mg,13.2±1.3 ng/mg,P<0.05,P<0.01),但是 MTB-18067.95 mg/kg组与NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。2.4 5-HT含量变化:与假手术组相比,MCAO组(38.6±5.7 ng/mg,P<0.01),抑郁组(42.9±6.6 ng/mg,P<0.01)和 PSD 组(34.4±7.5 ng/mg,P<0.01)的 5-HT水平显著低于假手术组(63.8±6.9 ng/mg)。与抑郁组相比,给予MTB-1806 7.95 mg/kg和NBP 4.67 mg/kg治疗后,提高了大鼠脑内5-HT的水平(54.6±4.4 ng/mg,52.1±4.8 ng/mg,P<0.05)。与 PSD 组相比,给予 MTB-1806 7.95 mg/kg 和 NBP 4.67 mg/kg 治疗显著提高了大鼠脑内 5-HT 水平(52.6±6.3 ng/mg,49.2±5.1 ng/mg,P<0.01),但是MTB-1806 7.95 mg/kg组与NBP 4.67 mg/kg组之间无统计学差异(P>0.05)。结论:MTB-1806能增加PSD大鼠的体重、蔗糖水消耗比例、水平和垂直得分,其作用机制与增加PSD大鼠脑内单胺类神经递质的含量有关。第Ⅲ部分MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞损伤后单胺类神经递质的影响目的:探究MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用以及对单胺类神经递质的影响。方法:H2O2损伤模型的建立:用700 μmol/LH2O2的低糖培养基诱导PC12细胞损伤24h,然后换正常培养基培养24h。分组随机分为6组:Sham组,Model组,NBP 30 μmol/L组,MTB-1806(1,10,30 μmol/L)组。MTB-1806组和NBP组均先加药预处理24小时,再进行H2O2损伤处理。观察指标:观察MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用;用ELISA试剂盒检测细胞上清中去甲肾上腺素(NA),多巴胺(DA),5-羟色胺(5-HT)和乙酰胆碱(Ach)的含量。结果:1.MTB-1806量效关系曲线的确定与Sham组相比,Model组PC12细胞存活率明显降低(53.0%;P<0.01);与Model组相比,经MTB-1806(1,5,10,20,30,40 μmol/L)预处理的PC12细胞存活率明显提高,分别为(55.1%,62.9%,72.1%,79.2%,85.1%,82.0%,P<0.05,P<0.01);MTB-1806 40 μmol/L预处理的PC12细胞与MTB-1806 30μmol/L预处理的PC12细胞相比存活率略有下降,故MTB-1806 30 μmol/L为MTB-1806的最高有效浓度。综上所述,实验选择终浓度MTB-1806 30 μmol/L作为对单胺类神经递质的探讨。2.DA含量的变化与Sham组(36.31±4.57 pg/ml)相比,Model组DA的含量明显降低(10.65±4.96 pg/ml;P<0.01);与Model组相比,MTB-1806(10,30 μmol/L)能剂量依赖性地增加DA含量,分别为(18.3313.13 pg/ml,20.81±5.06 pg/ml,P<0.05)。等摩尔浓度的MTB-1806组和NBP组相比,无统计学差异(P>0.05)。3.NA含量的变化与Sham组(18.09±1.97 pg/ml相比,Model组NA的含量明显降低(10.32±2.13 pg/ml;P<0.01);与Model组相比,MTB-1806(10,30 μmol/L)能剂量依赖性地增加NA含量,分别为(12.26±1.43 pg/ml,15.67±1.56pg/ml,P<0.05)。等摩尔剂量的MTB-1806组和NBP组相比,无统计学差异(P>0.05)。4.ACh含量的变化与Sham组(24.38±3.75pg/ml)相比,Model组ACh的含量明显降低(10.52±1.97pg/ml;P<0.01);与Model组相比,MTB-1806(10,30μmol/L)能剂量依赖性地增加ACh量,分别为(15.68±4.12pg/ml,21.71±3.35 pg/ml,P<0.01)。等摩尔浓度的MTB-1806组和NBP组相比,无统计学差异(P>0.05)。5.5-HT含量的变化与Sham组(176.10±23.65 pg/ml)相比,Model组5-HT的含量明显降低(103.27±20.11 pg/ml;P<0.01);与Model组相比,MTB-1806(10,30 μmol/L)能剂量依赖性地增加5-HT含量,分别为(153.71±19.47 pg/ml,169.92±25.56 pg/ml,P<0.05)。等摩尔浓度的MTB-1806组和NBP组相比,无统计学差异(P>0.05)。结论:MTB-1806对H2O2诱导的PC12细胞损伤有保护作用,并且能够增加DA,NA,ACh,和5-HT的含量。