拟南芥硝态氮调控基因NRG3的克隆与功能鉴定

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氮素是植物生长发育所必需的重要营养成分,它参与了植物生长过程中的很多生理过程,如促进根的生长、调节植物发育等。目前,已研究发现几个硝态氮调控基因,其中 NRT1.1被证明是一个硝态氮的感应子,在硝酸感应和运输方面起重要作用;NLP7是一个转录因子,可以与响应硝酸的顺式元件结合来对硝态氮进行调控。但是由于发现的硝态氮调控基因还很少,关于硝态氮调控的分子机制的研究还不够深入。  本研究利用新建立的硝态氮调控突变体筛选系统找到一个新的突变体,在受硝酸诱导后,其响应硝态氮的信号明显比野生型弱。利用图位克隆的方法克隆出了突变基因,发现该基因所在家族共有15个成员,整个家族所有成员的功能都尚未被鉴定出来,我们将该基因命名为NRG3。  利用NRG3的两个T-DNA插入突变体株系对这个基因进行研究,当突变体在琥珀酸铵培养基上生长7天并经KNO3处理2小时后,硝酸诱导基因的诱导量显著低于野生型,表明NRG3是一个新的硝态氮调控基因。在琥珀酸铵培养基生长6天、氮饥饿处理1天后,同样用KNO3处理2小时,突变体中硝酸诱导基因的诱导量与野生型中的诱导量无显著差别。对根中的硝酸含量测定后发现,突变体中硝酸含量要比野生型中低,而突变体叶中的硝酸含量与野生型相比则没有明显差别。  利用qPCR和GUS报告基因对NRG3的组织定位进行研究,发现NRG3主要表达在根和叶的维管组织中,在花和茎中也有表达,在维管组织中则主要表达在木质部薄壁细胞及韧皮部。用GFP融合蛋白对NRG3的亚细胞定位分析得知,NRG3蛋白主要表达在细胞核中。  实验利用单、双突变体和qPCR法研究了NRG3和NRT1.1的关系。NRT1.1和NRG3的双突变体荧光表现与单突变体中荧光弱的类似,这说明这两个基因对于硝态氮调控的作用是不能叠加的,它们在一条信号通路上影响硝态氮的调控。定量结果显示,在NRG3的突变体中NRT1.1的表达量下降,而NRG3在NRT1.1基因的突变体中表达量没有变化,所以我们推断,NRG3位于NRT1.1基因的上游,NRG3调控NRT1.1的表达。  本实验又继续研究了NRG3和NLP7的关系,发现这两个基因的双突变体荧光亮度比单突变体都弱。利用酵母双杂和BiFC实验发现,NLP7与NRG3存在互作关系。据此我们推测,NRG3能与NLP7互作,并都在调控硝态氮信号响应的不同途径中发挥重要作用。  鉴于NRG3基因在植物输导组织中表达量较高,本研究又检测了硝酸转运基因在突变体中的表达,结果发现,NRT1.8的表达量升高,而且NRG3的表达与NRT1.8的表达部位相似,故推测NGR3突变体根中硝态氮含量的降低是由于NRT1.8的表达增加造成的。  综上所述,我们发现并克隆一个新的硝态氮调控基因NRG3,它调控了NRT1.1的表达,并且与NLP7互作,共同调控了植物对硝态氮的响应。
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