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哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)属于拟杆菌门(Bacteroidetes)革兰氏阴性好氧菌，广泛存在于土壤中，能够快速降解纤维素，可滑动。C.hutchinsonii的纤维素降解过程不同于常见的向胞外分泌完整游离纤维素酶降解机制和细胞表面形成纤维小体结构降解机制，同时C.hutchinsonii也不具有鞭毛或者菌毛结构，其独特的纤维素降解机制和滑动机制尚且未知。
第三种降解机制认为，细胞表面存在蛋白复合体，当菌体与纤维素直接接触降解时，复合体可以将纤维素链剥离并转运到周质空间进行进一步降解。本实验室前期研究发现C.hutchinsonii存在细胞表面和周质空间两种纤维素降解途径，细胞表面蛋白在细胞表面参与纤维素的吸附和解构。因此外膜蛋白在细胞表面的正常修饰和锚定对其纤维素降解过程起关键作用。T9SS仅存在于拟杆菌门微生物中，蛋白C端CTD序列可被T9SS识别，跨外膜转运至细胞表面或胞外。已发现除细胞表面纤维素酶外，C.hutchinsonii还存在许多具有CTD结构域的蛋白对纤维素的吸附及结晶区降解起重要作用，然而这些蛋白如何锚定于外膜却仍未知。
本文中，利用转座子插入突变技术我们筛选到多个影响纤维素降解的基因，对其中两个参与脂多糖(Lipopolysaccharide)合成相关的基因chu_2777和chu_1044的功能进行了研究，初步确定了T9SS底物蛋白CTD蛋白在细胞表面的锚定方式，具体内容如下:
C.hutchinsoniiLPSO-antigen翻转酶的功能研究:插入突变筛选到基因chu_2777(rfbX)，可能是O-antigen翻转酶，定位于细胞质膜，属于MATE_likesuperfamily，具有该家族蛋白典型的12个跨膜结构域，生物信息学分析比对发现C.hutchinsonii中还存在三个MATE_likesuperfamilyprotein，分别为CHU_2176、CHU_2507(wzxE)、CHU_2883(wzxC)，同时敲除验证其表型。
chu_2777和chu_2176敲除后，突变株均无法降解滤纸，在液体培养条件下降解结晶纤维素Avicel和无定形纤维素RAC的能力均减弱，运动能力丧失，LPS的O-antigen部分缺失，而△2507、△2883以上表型均与WT无异，说明chu_2507和chu_2883可能是冗余基因，不参与LPS的合成过程，或者翻转其他类型的多糖单元。
△2777和△2176的细胞表面内切纤维素酶酶活几乎完全丧失，裂解细胞的内切纤维素酶酶活在生长前期下降最为明显，比WT降低50％左右，细胞表面和裂解细胞中的β-葡萄糖苷酶酶活在前期都比WT降低40％左右。纤维素酶活性电泳显示敲除株细胞表面纤维素酶明显减少，而胞外组分中纤维素酶分布量比WT高。通过细胞表面蛋白组学在WT的细胞表面鉴定到47个A型CTD蛋白(TIGR04183)，而△2777的细胞表面缺失了其中的22个，△2176表面缺失了28个，包括纤维素酶CHU_1336、CHU_1335等。蛋白免疫印迹实验进一步证明A型CTD蛋白纤维素酶CHU_1336在敲除株的外膜上锚定失败，被大量分泌到胞外，B型CTD蛋白(pfam13585)CHU_3220在WT和敲除株中的定位无变化。以上结果均表明LPS对T9SS底物蛋白在细胞表面的锚定具有重要作用，首次揭示了LPS影响C.hutchinsonii纤维素降解能力的原因。
另外，我们发现WT的部分外膜蛋白表观分子量比敲除株大，并初步探究了造成这一现象的原因。选择其中一个差异蛋白CHU_0125进行原位表达，CHU_0125预测成熟蛋白分子量为71.8kDa，Westernblot结果显示在周质中存在约70kDa和85kDa两条带，在外膜上的条带约100kDa，说明CHU_0125在周质和外膜均存在修饰导致其表观分子量变大。糖苷内切酶PNGaseF可以将与蛋白Asn处连接的聚糖切割而引起蛋白在酶切前后的分子量差异，当用PNGaseF处理蛋白0125-FLAG-tag时，分子量无差异，推测CHU_0125存在的修饰不是N-糖基化修饰，外膜上的修饰推测可能由LPS引起。用高碘酸氧化法对不同组分的糖蛋白进行染色，发现WT的周质和外膜部分均存在大量被糖基化修饰的蛋白，而△2777和△2176仅有数条可见的糖蛋白，大量蛋白糖基化修饰现象消失，进一步说明LPS合成相关的基因可能参与了C.hutchinsonii蛋白的糖基化修饰过程，其修饰过程和方式以及生理生化意义都需要进一步探究。
同时△2777和△2176生物膜形成能力和抗逆性均降低，这可能与O-antigen的缺失破坏了菌体的外膜完整性有关。
糖基转移酶CHU_1044的功能研究:插入突变筛选到一个编码b-型糖基转移酶，糖基转移酶2家族蛋白的基因chu_1044。CHU_1044定位于细胞内膜，有7个跨膜结构域，与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的糖基转移酶gtfC有58.7％的氨基酸序列一致性，gtfC已被证明参与了P.gingivalis阴离子脂多糖(Anionic Lipopolysaccharide)的合成。
敲除该基因导致LPS的O-antigen缺失、菌体无法降解滤纸、在软硬琼脂上的扩散障碍、无法像WT一样整齐排列于滤纸纤维表面。△1044的细胞表面内切纤维素酶活性几乎完全丧失，而全细胞内切纤维素酶活在生长前期有50％以上的下降，细胞表面和全细胞的β-葡萄糖苷酶酶活性在生长前期也下降明显。复性电泳法分析纤维素酶活性，发现△1044的周质和外膜纤维素酶的分布量明显少于WT，胞外纤维素酶的丰度却高于WT。我们用蛋白质组学技术鉴定了WT和△1044细胞表面蛋白，△1044的细胞表面仅鉴定到14个A型CTD蛋白，而WT细胞表面鉴定到47个，这与△2777和△2176的实验结果一致。目前预测的18个纤维素酶中，有12个具有A-型CTD序列，是T9SS的底物蛋白，在C.hutchinsonii的细胞表面纤维素降解途径中起重要作用，因此推测LPS的缺失引起A型CTD蛋白无法正常锚定于细胞表面是△1044无法降解纤维素的主要原因。
△1044的细胞外膜也有大量蛋白表观分子量小于WT。糖基化修饰过程需要多个糖基转移酶的参与，提取WT和△1044不同组分蛋白，用高碘酸氧化法对糖蛋白进行染色，实验结果表明chu_1044的缺失确实导致大量蛋白的糖基化修饰丧失。考虑到chu_1044同样也参与了LPSO-antigen的合成，因此chu_1044参与的糖基化修饰过程可能是与O-antigen的合成过程偶联的，这还需要进一步实验验证。
P.gingivalis中CTD蛋白通过阴离子脂多糖A-LPS锚定于细胞表面，目前无证据支持C.hutchinsonii存在A-LPS。我们通过对C.hutchinsoniiLPS合成相关基因O-antigen翻转酶chu_2777、chu_2176和糖基转移酶chu_1044功能的初步研究，推测C.hutchinsonii中A型CTD是通过LPS而锚定于细胞表面的。不同于外膜蛋白常见的直接插入外膜或形成复合体形式的锚定，这种通过与LPS连接的锚定使蛋白完全暴露在外膜表面，更有利于纤维素酶与底物的接触，因此有利于对纤维素的高效降解。同时我们对C.hutchinsonii的周质和外膜蛋白的糖基化修饰现象进行了初步探究。这为进一步阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解和滑动机制提供了新思路，为探究拟杆菌门微生物表面蛋白的修饰和锚定方式提供了参考。
第三种降解机制认为，细胞表面存在蛋白复合体，当菌体与纤维素直接接触降解时，复合体可以将纤维素链剥离并转运到周质空间进行进一步降解。本实验室前期研究发现C.hutchinsonii存在细胞表面和周质空间两种纤维素降解途径，细胞表面蛋白在细胞表面参与纤维素的吸附和解构。因此外膜蛋白在细胞表面的正常修饰和锚定对其纤维素降解过程起关键作用。T9SS仅存在于拟杆菌门微生物中，蛋白C端CTD序列可被T9SS识别，跨外膜转运至细胞表面或胞外。已发现除细胞表面纤维素酶外，C.hutchinsonii还存在许多具有CTD结构域的蛋白对纤维素的吸附及结晶区降解起重要作用，然而这些蛋白如何锚定于外膜却仍未知。
本文中，利用转座子插入突变技术我们筛选到多个影响纤维素降解的基因，对其中两个参与脂多糖(Lipopolysaccharide)合成相关的基因chu_2777和chu_1044的功能进行了研究，初步确定了T9SS底物蛋白CTD蛋白在细胞表面的锚定方式，具体内容如下:
C.hutchinsoniiLPSO-antigen翻转酶的功能研究:插入突变筛选到基因chu_2777(rfbX)，可能是O-antigen翻转酶，定位于细胞质膜，属于MATE_likesuperfamily，具有该家族蛋白典型的12个跨膜结构域，生物信息学分析比对发现C.hutchinsonii中还存在三个MATE_likesuperfamilyprotein，分别为CHU_2176、CHU_2507(wzxE)、CHU_2883(wzxC)，同时敲除验证其表型。
chu_2777和chu_2176敲除后，突变株均无法降解滤纸，在液体培养条件下降解结晶纤维素Avicel和无定形纤维素RAC的能力均减弱，运动能力丧失，LPS的O-antigen部分缺失，而△2507、△2883以上表型均与WT无异，说明chu_2507和chu_2883可能是冗余基因，不参与LPS的合成过程，或者翻转其他类型的多糖单元。
△2777和△2176的细胞表面内切纤维素酶酶活几乎完全丧失，裂解细胞的内切纤维素酶酶活在生长前期下降最为明显，比WT降低50％左右，细胞表面和裂解细胞中的β-葡萄糖苷酶酶活在前期都比WT降低40％左右。纤维素酶活性电泳显示敲除株细胞表面纤维素酶明显减少，而胞外组分中纤维素酶分布量比WT高。通过细胞表面蛋白组学在WT的细胞表面鉴定到47个A型CTD蛋白(TIGR04183)，而△2777的细胞表面缺失了其中的22个，△2176表面缺失了28个，包括纤维素酶CHU_1336、CHU_1335等。蛋白免疫印迹实验进一步证明A型CTD蛋白纤维素酶CHU_1336在敲除株的外膜上锚定失败，被大量分泌到胞外，B型CTD蛋白(pfam13585)CHU_3220在WT和敲除株中的定位无变化。以上结果均表明LPS对T9SS底物蛋白在细胞表面的锚定具有重要作用，首次揭示了LPS影响C.hutchinsonii纤维素降解能力的原因。
另外，我们发现WT的部分外膜蛋白表观分子量比敲除株大，并初步探究了造成这一现象的原因。选择其中一个差异蛋白CHU_0125进行原位表达，CHU_0125预测成熟蛋白分子量为71.8kDa，Westernblot结果显示在周质中存在约70kDa和85kDa两条带，在外膜上的条带约100kDa，说明CHU_0125在周质和外膜均存在修饰导致其表观分子量变大。糖苷内切酶PNGaseF可以将与蛋白Asn处连接的聚糖切割而引起蛋白在酶切前后的分子量差异，当用PNGaseF处理蛋白0125-FLAG-tag时，分子量无差异，推测CHU_0125存在的修饰不是N-糖基化修饰，外膜上的修饰推测可能由LPS引起。用高碘酸氧化法对不同组分的糖蛋白进行染色，发现WT的周质和外膜部分均存在大量被糖基化修饰的蛋白，而△2777和△2176仅有数条可见的糖蛋白，大量蛋白糖基化修饰现象消失，进一步说明LPS合成相关的基因可能参与了C.hutchinsonii蛋白的糖基化修饰过程，其修饰过程和方式以及生理生化意义都需要进一步探究。
同时△2777和△2176生物膜形成能力和抗逆性均降低，这可能与O-antigen的缺失破坏了菌体的外膜完整性有关。
糖基转移酶CHU_1044的功能研究:插入突变筛选到一个编码b-型糖基转移酶，糖基转移酶2家族蛋白的基因chu_1044。CHU_1044定位于细胞内膜，有7个跨膜结构域，与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的糖基转移酶gtfC有58.7％的氨基酸序列一致性，gtfC已被证明参与了P.gingivalis阴离子脂多糖(Anionic Lipopolysaccharide)的合成。
敲除该基因导致LPS的O-antigen缺失、菌体无法降解滤纸、在软硬琼脂上的扩散障碍、无法像WT一样整齐排列于滤纸纤维表面。△1044的细胞表面内切纤维素酶活性几乎完全丧失，而全细胞内切纤维素酶活在生长前期有50％以上的下降，细胞表面和全细胞的β-葡萄糖苷酶酶活性在生长前期也下降明显。复性电泳法分析纤维素酶活性，发现△1044的周质和外膜纤维素酶的分布量明显少于WT，胞外纤维素酶的丰度却高于WT。我们用蛋白质组学技术鉴定了WT和△1044细胞表面蛋白，△1044的细胞表面仅鉴定到14个A型CTD蛋白，而WT细胞表面鉴定到47个，这与△2777和△2176的实验结果一致。目前预测的18个纤维素酶中，有12个具有A-型CTD序列，是T9SS的底物蛋白，在C.hutchinsonii的细胞表面纤维素降解途径中起重要作用，因此推测LPS的缺失引起A型CTD蛋白无法正常锚定于细胞表面是△1044无法降解纤维素的主要原因。
△1044的细胞外膜也有大量蛋白表观分子量小于WT。糖基化修饰过程需要多个糖基转移酶的参与，提取WT和△1044不同组分蛋白，用高碘酸氧化法对糖蛋白进行染色，实验结果表明chu_1044的缺失确实导致大量蛋白的糖基化修饰丧失。考虑到chu_1044同样也参与了LPSO-antigen的合成，因此chu_1044参与的糖基化修饰过程可能是与O-antigen的合成过程偶联的，这还需要进一步实验验证。
P.gingivalis中CTD蛋白通过阴离子脂多糖A-LPS锚定于细胞表面，目前无证据支持C.hutchinsonii存在A-LPS。我们通过对C.hutchinsoniiLPS合成相关基因O-antigen翻转酶chu_2777、chu_2176和糖基转移酶chu_1044功能的初步研究，推测C.hutchinsonii中A型CTD是通过LPS而锚定于细胞表面的。不同于外膜蛋白常见的直接插入外膜或形成复合体形式的锚定，这种通过与LPS连接的锚定使蛋白完全暴露在外膜表面，更有利于纤维素酶与底物的接触，因此有利于对纤维素的高效降解。同时我们对C.hutchinsonii的周质和外膜蛋白的糖基化修饰现象进行了初步探究。这为进一步阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解和滑动机制提供了新思路，为探究拟杆菌门微生物表面蛋白的修饰和锚定方式提供了参考。