马铃薯（Solanum tuberosum L.）为茄科一年生草本植物,是继小麦、水稻和玉米之后的重要粮食与蔬菜兼用型作物。块茎休眠期的长短对马铃薯的栽培、生产以及进一步精深加工具有重要意义。前人研究表明活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在马铃薯块茎的休眠与萌发过程中具有重要的调控作用。植物呼吸爆发氧化酶（Respiratory burst oxidase homologue,Rboh）又称NADPH氧化酶,能催化胞外O2产生超氧阴离子（O2-·）和H2O2等活性氧。本试验克隆得到StRbohA和StRbohB基因编码序列及其对应启动子,并对其基因功能进行研究。主要结果如下:1.克隆得到StRbohA和StRbohB基因的CDS全长分别为2892bp和2604bp。分别构建过量表达载体p BI121-StRbohA、p BI121-StRbohB以及RNAi干扰载体p Bin19-StRbohA、p Bin19-StRbohB。用农杆菌侵染法侵染―Wh-15‖马铃薯块茎,并通过qRT-PCR等方法对转基因植株进行鉴定。最终获得过量表达StRbohA和StRbohB基因的马铃薯转基因植株分别为3株和4株;RNAi干扰表达马铃薯转基因植株分别为3株和2株。与野生型植株相比,过表达StRbohB转基因幼苗出现了植株矮化、叶面积减小等表型变化。2.通过qRT-PCR方法对StRbohA与StRbohB基因在马铃薯营养器官中的表达模式进行了分析。结果表明:StRbohA基因在根、茎、叶和块茎的表达量由高到低依次为叶、茎、根和块茎;而StRbohB基因表达量由高到低依次为为茎、叶、根和块茎。在正常生长条件下,StRbohA与StRbohB基因在块茎中的表达量最少。用100μM的ABA与GA3处理生长60天的野生型马铃薯幼苗24h,通过qRT-PCR分析我们发现经过ABA处理后,StRbohA基因仅在根中的表达量升高而StRbohB基因在根和块茎中的表达量均升高。经过GA3处理后,StRbohA基因在根与块茎中的表达量升高,而StRbohB基因在根、叶和块茎中的表达量均升高。这说明ABA与GA3处理马铃薯幼苗后,能够不同程度地诱导StRbohA与StRbohB基因在不同营养器官中的表达量升高。3.分别构建瞬时表达载体p Earlygate101-StRbohA和p Earlygate101-StRbohB,通过农杆菌侵染法将其转化烟草叶片,在激光共聚焦显微镜下观察到StRbohA与StRbohB蛋白均位于质膜上行使其功能。4.从StRbohA和StRbohB起始密码子上游克隆到长度分别为1943bp和2032bp的启动子片段StRbohAp和StRbohBp,构建融合GUS报告基因的表达载体p BI121-StRbohAp和p BI121-StRbohBp,并将该启动子表达载体对烟草幼苗和叶片进行瞬时转化和稳定转化。以p BI121空载体为阳性对照并进行GUS组织化学染色,结果表明StRbohAp和StRbohBp均具有启动子活性,且其驱动下游GUS表达的能力弱于Ca MV 35S启动子。在稳定转化的烟草植株中,我们观察到p BI121-StRbohBp转基因烟草植株的根、茎、叶中均呈现出了明显的蓝色;而在p BI121-StRbohAp转基因烟草植株中,仅在根和叶片中呈现出了少量蓝色小点。说明StRbohAp为组织特异性表达启动子,而StRbohBp组成型表达启动子。分别用50μM浓度ABA和GA3的激素对瞬时转化启动子表达载体的烟草幼苗处理3d,并通过qRT-PCR检测GUS基因表达量的变化。结果表明StRbohAp与StRbohBp能够分别响应ABA与GA信号而驱动下游GUS基因表达量升高。综上所述,StRbohA与StrbohB为膜蛋白,并且StRbohA与StRbohB在叶和茎组织中有着较高的表达量,ABA和GA3处理能够诱导其基因表达量在不同营养器官中呈现出不同变化。本研究对马铃薯块茎的休眠机制进行了探索,并获得了StRbohA与StRbohB过量表达和干扰表达转基因马铃薯植株以及StRbohAp与StRbohBp驱动GUS基因表达的转基因烟草植株,这为后期进一步的研究StRbohA与StRbohB基因对逆境胁迫的响应及在马铃薯块茎休眠过程中的具体调控作用奠定了较好的基础。以上结果对不同休眠特性马铃薯的品种选育、农业生产和储藏加工具有一定的参考价值。