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【目的】miR-135a-5p在不同肿瘤中扮演着不同角色。既往研究发现miR-135a-5p在胶质瘤中表达异常降低,且生物信息学预测显示肿瘤坏死因子受体相关因子5(TRAF5)的编码基因是miR-135a-5p的潜在靶基因。作为一种重要的信号转导因子,TRAF5在包括胶质瘤在内的多种肿瘤中异常高表达。然而,胶质瘤细胞中miR-135a-5p是否可以靶向沉默TRAF5,二者表达水平与胶质瘤细胞增殖及患者预后的关系如何,miR-135a-5p表达异常降低在胶质瘤发生发展中的意义以及补充外源性miR-135a-5p可发挥何种胶质瘤抑瘤作用,其分子机制如何均尚需进一步研究。本研究的目的在于:(1)检测miR-135a-5p及TRAF5在不同级别胶质瘤中的表达情况,分析二者之间表达的相关性及二者表达水平与肿瘤细胞增殖和患者生存期的关系;(2)在胶质瘤细胞中证实TRAF5是否为miR-135a-5p的天然靶基因;(3)通过体内外实验观察miR-135a-5p和TRAF5对胶质瘤细胞周期和细胞增殖的影响,以及其在荷瘤裸鼠的抗肿瘤效应;(4)在此基础上进一步探索二者调控胶质瘤细胞增殖的分子机制。【方法】1.采用组织微阵列、锁定寡核苷酸探针原位杂交和免疫组织化学技术检测120例不同级别胶质瘤及20例非肿瘤对照脑组织中miR-135a-5p、TRAF5和Ki-67的表达水平,分析三者在不同级别胶质瘤间的表达变化;采用Pearson相关性检验分析三者阳性标记指数之间的相关关系;结合临床随访资料,用Kaplan-Meiers法分析miR-135a-5p或TRAF5表达水平与患者生存期的关系;建立Cox比例风险回归模型,筛选胶质瘤患者预后的独立预测因子。2.生物信息学软件分析预测miR-135a-5p的潜在靶点,利用荧光素酶实验验证在胶质瘤中TRAF5是否为miR-135a-5p的靶基因。3.分别构建介导miR-135a-5p和TRAF5过表达的重组慢病毒和对照慢病毒,利用qRT-PCR和Western blot检测慢病毒感染后其携带的外源性基因的表达效率。利用相应重组慢病毒感染人胶质母细胞瘤细胞系U251及U87MG,分别构建单纯过表达miR-135a-5p的亚细胞系U251/U87MG-miR-135a-5p,联合过表达miR-135a-5p和TRAF5的亚细胞系U251/U87MG-miR-135a-5p+TRAF5及对照亚细胞系U251/U87MG-Con。4.采用qRT-PCR及Western blot检测对照及miR-135a-5p过表达亚细胞系TRAF5 mRNA及蛋白的表达水平,检测miR-135a-5p对TRAF5的沉默效率并探索其分子机制。5.采用流式细胞术(FCM)细胞周期检测、EdU及MTS实验检测U251及U87MG各亚细胞系的细胞周期分布和增殖活性,观察过表达miR-135a-5p对胶质瘤细胞增殖的影响,以及补充外源性TRAF5能否逆转miR-135a-5p的增殖抑制效应。6.设计并合成TRAF5的siRNA(siTRAF5#1、siTRAF5#2),利用qRT-PCR及Western blot检测其对U251和U87MG细胞内源性TRAF5的沉默效率;利用FCM、EdU及MTS实验检测靶向敲低内源性TRAF5能否模拟miR-135a-5p对胶质瘤细胞细胞周期分布和增殖的影响。7.利用U87MG各稳定亚细胞系(U87-Con、miR-135a-5p、miR-135a-5p+TRAF5)建立裸鼠颅内原位移植瘤模型,观察各组小鼠的体重和生存期,并利用活体成像技术监测移植瘤的生长;移植瘤取出后经HE染色观察肿瘤细胞的生长情况,免疫组织化学染色检测移植瘤组织TRAF5和Ki-67的表达水平。8.采用Western blot检测U251和U87MG稳定亚细胞系(Con、miR-135a-5p、miR-135a-5p+TRAF5)及瞬时转染siTRAF5(siTRAF5#1、siTRAF5#2)的U251和U87MG细胞中TRAF5、p-AKT、AKT、c-Myc、cyclin D1的表达水平,探索miR-135a-5p通过靶向TRAF5影响胶质瘤细胞周期细胞分布和增殖的分子机制。【结果】1.原位杂交结果显示,与非肿瘤对照脑组织相比,各级别胶质瘤组织中miR-135a-5p的表达水平均明显降低,且其阳性标记指数随肿瘤良恶性级别的升高而降低,各组间差异均有统计学意义(P<0.001);免疫组化结果显示,各级别胶质瘤组织的TRAF5和Ki-67表达水平均明显高于对照脑组织,且其阳性标记指数随肿瘤良恶性级别的升高而升高,各组间差异亦均有统计学意义(P<0.001)。相关分析显示,miR-135a-5p LI%与TRAF5 LI%(r=-0.831;P<0.0001)和Ki-67LI%均呈显著负相关(r=-0.782;P<0.0001),而TRAF5 LI%与Ki-67 LI%呈显著正相关(r=0.946;P<0.0001)。上述结果高度提示在胶质瘤组织中存在miR-135a-5p和TRAF5之间的负性调节作用,且二者分别是肿瘤细胞增殖的负和正调控因子。2.Kaplan-Meier生存分析结果显示,无论在全部120例胶质瘤患者中,还是在按胶质瘤级别、IDH基因状态、年龄或KPS评分划分的胶质瘤患者亚群中,miR-135a-5p高表达组及TRAF5低表达组胶质瘤患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)分别长于miR-135a-5p低表达组和TRAF5高表达组患者,差异有统计学意义(P<0.01~0.0001)。Cox回归分析显示,miR-135a-5p和TRAF5的阳性标记指数均为胶质瘤患者DFS和OS的独立预测因子。3.生物信息学预测显示,TRAF5 mRNA的3’UTR区第422~428位的核苷酸与miR-135a-5p的种子序列互补,提示TRAF5是miR-135a-5p的潜在靶基因。荧光素酶实验结果显示,在U251及U87MG胶质瘤细胞系中,携带miR-135a-5p靶序列的野生型TRAF5 mRNA 3’-UTR可通过与该miRNA结合介导上游荧光素酶报告基因的沉默,而删除了靶序列的突变型TRAF5 mRNA 3’-UTR则不能介导该沉默效应。qRT-PCR和Western blot实验结果显示,miR-135a-5p过表达U251和U87MG亚细胞系(U251/U87MG-miR-135a-5p)的TRAF5 mRNA及蛋白的表达水平均明显低于相应的对照亚细胞系(U251/U87MG-Con,P<0.5~0.01)。以上结果证实,在胶质瘤细胞中TRAF5是miR-135a-5p的天然靶基因,后者可通过诱导TRAF5 mRNA的降解抑制其编码蛋白的表达。4.FCM细胞周期检测结果显示,各miR-135a-5p亚细胞系的G0/G1期细胞百分比均明显高于相应Con亚细胞系及miR-135a-5p和TRAF5联合过表达细胞系(U251/U87MG-miR-135a-5p+TRAF5,P<0.01);相应地,EdU及MTS实验结果显示,各miR-135a-5p亚细胞系的细胞增殖活性明显低于相应Con亚细胞系及miR-135a-5p+TRAF5亚细胞系(P<0.01~0.001)。以上结果证实miR-135a-5p可通过诱导G1期阻滞有效抑制胶质瘤细胞的增殖,而补充外源性TRAF5可逆转miR-135a-5p的增殖抑制效应。5.qRT-PCR及Western blot检测结果显示转染siTRAF5s可明显降低U251和U87MG细胞中TRAF5的mRNA含量和蛋白表达水平;FCM结果显示,siTRAF5转染组的G0/G1期细胞比例明显高于对照(Scr转染)组(P<0.001)。EdU及MTS结果显示,siTRAF5s能有效抑制U251和U87MG的增殖活性(P<0.05~0.001)。以上结果证实特异性敲低内源性TRAF5可模拟miR-135a-5p对胶质瘤细胞的增殖抑制效应。6.裸鼠移植瘤实验结果显示,miR-135a-5p组小鼠移植瘤生长速度和体重降低速度明显低于Con组和miR-135a-5p+TRAF5组。病理检测结果显示,miR-135a-5p组移植瘤的肿瘤细胞密度和Ki-67阳性标记指数均明显低于其余两组(P<0.05~0.001)。以上结果证实在体内条件下,miR-135a-5p亦可通过敲低TRAF5的表达抑制移植瘤细胞的增殖活性。7.Western blot结果显示,miR-135a-5p能有效抑制U251和U87MG细胞中AKT的磷酸化以及c-Myc和cyclin D1蛋白的表达。补充外源性TRAF5能逆转miR-135a-5p对上述蛋白表达和修饰的抑制作用,而利用siRNA特异性沉默TRAF5则可模拟miR-135a-5p的上述效应。【结论】1.胶质瘤中普遍存在miR-135a-5p异常低表达及TRAF5异常高表达。随着胶质瘤良恶性级别和肿瘤细胞增殖活性的升高,miR-135a-5p表达水平逐渐降低,而TRAF5表达水平逐渐升高。miR-135a-5p和TRAF5表达水平可作为辅助胶质瘤良恶性分级和评价肿瘤细胞增殖活性的重要参考指标。2.胶质瘤细胞miR-135a-5p和TRAF5表达水平与患者的无病生存期和总体生存期密切相关,二者分别是胶质瘤患者生存的保护因子和风险因子,并均为患者预后的独立预测因子。3.在胶质瘤细胞中TRAF5是miR-135a-5p的天然靶基因,miR-135a-5p通过诱导TRAF5 mRNA降解和(/或)抑制其翻译过程在转录后水平抑制TRAF5蛋白的表达。在胶质瘤细胞中普通存在的miR-135a-5p低表达很可能是导致其TRAF5表达异常增高的重要原因。4.miR-135a-5p和TRAF5表达异常是导致胶质瘤细胞细胞周期调控紊乱和无限活跃增殖的重要原因之一,并在胶质瘤的发生发展中发挥重要作用。5.补充外源性miR-135a-5p可通过靶向沉默TRAF5抑制AKT的磷酸化和AKT通路的激活,进而抑制下游c-Myc和cyclin D1的表达,诱导胶质瘤细胞的G1期阻滞,并藉此在体内、外抑制胶质瘤细胞的增殖。6.本研究证实了miR-135a-5p是胶质瘤的抑瘤miRNA,观察了其对胶质瘤细胞的增殖抑制效应,筛选出TRAF5为介导该效应的靶基因,并确定了miR-135a-5p通过靶向TRAF5抑制肿瘤细胞增殖的效应通路。本研究结果高度提示,TRAF5可作为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗的重要候选靶点,而miR-135a-5p则可作为有效抑瘤因子用于恶性胶质瘤的基因治疗。