背景：血管生成是一个复杂的多步骤过程,其参与创面愈合、胚胎发生和生殖等众多生理过程以及肿瘤、自身免疫性疾病、年龄相关黄斑变性和动脉粥样硬化等一系列病理过程。内皮细胞是血管生成过程中必不可少的一员,它出芽、增殖、迁移、围成管样结构,还与周细胞共同决定和调节新生血管的稳定性。近年来,越来越多的人开始关注交感神经在血管新生中充当的生物学角色。种种迹象提示我们,交感神经(节后神经递质／肾上腺素能受体α-AR/β-AR在血管生成中扮演了重要角色。大量实验结果表明,内皮细胞p-AR阻断后,细胞体外增殖、迁移及成管皆被抑制,但是a-AR阻断及α-AR、β-AR同时阻断后内皮细胞体外血管生成功能的变化尚不明确。第一部分：普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。方法1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰多聚甲醛固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子(vWF)一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时(避光)。Hochest (1μg/ml)染核15分钟(避光)后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片(×200倍)。2. Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。3.细胞增殖实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔(0,25,50,75,100μM)、酚妥拉明(0,10,30,50,70 μg/ml)分别处理细胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中继续培养2h。之后于酶标仪测450nm下吸光度值。4.细胞毒性实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔(0,25,50,75,100μM)、酚妥拉明(0,10,30,50,70μg/m1)分别处理细胞48h。收集细胞上清液各60μl于96孔板内,每孔加入60μl乳酸脱氢酶工作液。室温30分钟后,于酶标仪测490nm下吸光度值。5.细胞划痕实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于24孔板,细胞融合100%后,低血清培养基饥饿24h,用20μl枪头在孔板中央划宽约1mm划痕,PBS洗去死细胞,各孔加入含不同浓度普萘洛尔(0,0.1,1,10,20,30μM)、酚妥拉明(0,0.1,1,10,20,40μg/m1)的低血清培养基,继续孵箱内培养。倒置荧光显微镜下观察0,12,24,48 h划痕愈合情况并拍照(40倍)。6.细胞成管实验：Matrigel基质胶(12.5 mg/m1)在4℃溶解,24孔板、枪头皆预冷,冰上操作。于24孔板中加入100μl基质胶,均匀平铺。将其放入37℃孵箱,待基质胶凝固后,分别均匀加入500μl含1.5×105个人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞的完全培养基,继续在37℃孵箱中孵育。待细胞贴壁后,去除旧培养基,分别加入含0、50LM普萘洛尔、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培养基,倒置荧光显微镜下观察0,4,8,12,24h细胞在基质胶上的管样形成情况并拍照(40倍)。7. ELISA法检测细胞VEGF的变化：将人皮肤微血管内皮细胞种植于6孔板,细胞融合至70%时,去掉旧培养基,PBS洗去残留培养基,加入分别含0、50μM普萘洛尔、0、50μg/ml酚妥拉明的高血清无内皮细胞生长添加剂的培养基,孵箱内培养48h。提取细胞总蛋白及细胞上清液,按VEGF ELISA试剂盒说明方法检测细胞内和细胞上清中VEGF的表达情况。8. ELISA法检测细胞VEGFR-2的变化：将人皮肤微血管内皮细胞种植于6孔板,细胞融合至70%时,去掉旧培养基,PBS洗去残留培养基,加入分别含0、50μM普萘洛尔、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培养基,孵箱内培养48h。提取细胞总蛋白,BCA定量,统一各孔蛋白量,按VEGFR-2 ELISA试剂盒说明方法检测细胞内VEGFR-2的表达情况。9. Western blot检测人皮肤微血管内皮细胞Ang1、Ang2、Tie-2的表达：将人皮肤微血管内皮细胞分别用含0、50μM普萘洛尔、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培养基培养48h后,裂解细胞获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗Ang1、Ang2、鼠单克隆抗Tie-2一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。结果1.两种细胞Ⅷ因子皆阳性,表明这两种细胞皆为内皮细胞来源。2.人脑微血管内皮细胞表达α1-AR(α1A-AR (50kDa)和α1D-AR (60kDa)亚型)和α2-AR (50 kDa)。人皮肤微血管内皮细胞表达α1-AR(位于34kDato43kDa之间的三个α1A-AR亚型(35kDa,37kDa和40kDa))和a2-AR(50 kDa),这是第一次报导人微血管来源内皮细胞表达α-AR。3. 普萘洛尔和酚妥拉明皆呈剂量依赖性抑制人皮肤微血管内皮细胞增殖,半抑制率分别位于50μM、 50kdg/ml附近。4. 细胞增殖实验中采用的浓度梯度内的药物未对细胞产生明显毒性作用,间接证明普萘洛尔和酚妥拉明减少细胞数量是因为药物本身对细胞增殖的抑制作用,而非药物对细胞的毒性作用。5.普萘洛尔和酚妥拉明皆抑制人皮肤微血管内皮细胞迁移。48h后,药物处理组(普萘洛尔20、30μM;酚妥拉明20、40dg/ml)划痕宽度明显大于对照组。低浓度药物组亦抑制细胞迁移,但不明显。6. 普萘洛尔和酚妥拉明皆抑制人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞成管。普萘洛尔抑制人皮肤微血管内皮细胞成管达40.3%、人脑微血管内皮细胞72.7%,酚妥拉明抑制人皮肤微血管内皮细胞成管达65.7%、人脑微血管内皮细胞77.7%。7. 普萘洛尔和酚妥拉明皆抑制人皮肤微血管内皮细胞VEGFR-2的表达,但是对胞内VEGF和上清VEGF无明显影响。普萘洛尔对人皮肤微血管内皮细胞VEGFR-2的抑制达22.4%,酚妥拉明抑制率达24.4%。对照组细胞上清中VEGF浓度很低(<13.9pg/ml),实验组上清中基本无VEGF,但二者无明显差异(p>0.05)。8.普萘洛尔和酚妥拉明皆抑制人皮肤微血管内皮细胞Ang1、Ang2的表达,但促进Tie-2的表达。结论普萘洛尔和酚妥拉明皆抑制内皮细胞增殖、迁移、成管,该作用可能与普萘洛尔和酚妥拉明抑制细胞VEGFR-2、Ang1、Ang2的表达有关。第二部分：同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,同时阻断人微血管内皮细胞α-AR、β-AR是否协同抑制细胞血管生成。方法1.实验分组：第一组：酚妥拉明50μg/ml;第二组：普萘洛尔50μM；第三组酚妥拉明50μg/ml+普萘洛尔50μM,分别进行增殖、成管实验及VEGF、 VEGFR-2、Ang1.Ang2、Tie-2的检测；划痕实验中,由于该实验营养条件降低,药物浓度降为酚妥拉明20μg/ml/普萘洛尔20μM。2.增殖、划痕、成管、ELISA.Westem blot具体方法见第一部分。结果1. 同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人皮肤微血管内皮细胞增殖。药物处理后,酚妥拉明+普萘洛尔组细胞数量较酚妥拉明组少45.5%,普萘洛尔组少43.5%。2. 同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人皮肤微血管内皮细胞迁移。48h后,酚妥拉明+普萘洛尔组划痕宽度明显大于酚妥拉明组和普萘洛尔组。3. 同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人皮肤微血管内皮细胞、人脑微血管内皮细胞成管。药物处理细胞后4h,酚妥拉明组和普萘洛尔组可见明显成管,酚妥拉明+普萘洛尔组成管不明显。药物处理细胞后8h,酚妥拉明组和普萘洛尔组成管数量及长度明显大于酚妥拉明+普萘洛尔组。4. 同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人皮肤微血管内皮细胞VEGFR-2的表达。药物作用48h后,酚妥拉明+普萘洛尔组酶标仪下OD值较酚妥拉明组少33.3%,较普萘洛尔组少35%。三个组胞内VEGF无明显差别,上清中基本无VEGF,亦无明显差别。5. 同时阻断α-AR、β-AR协同抑制人皮肤微血管内皮细胞Ang1、Ang2.Tie-2的表达。药物处理细胞后,酚妥拉明+普萘洛尔组细胞Ang1表达轻微下调,Ang2表达明显下调,而Tie-2表达明显下调,与预期中Tie-2表达应上升相反。结论同时阻断α-AR、β-AR协同抑制内皮细胞增殖、迁移、成管,协同抑制细胞VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2的表达。后者可能与前者有关。另外,该结果提示酚妥拉明和普萘洛尔体外抑制内皮细胞血管生成,可能与VEGF/VEGFR-2、 Ang/Tie-2通路障碍有关。