哺乳动物防御素具有抗菌能力强、抗菌作用广泛、不易使病原微生物产生耐药性等优点而受到人们广泛关注,其被认为是一种替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景。但猪体内天然防御素表达量低、分子小,分离提纯困难,化学合成防御素成本又太高。因此,基因工程技术成为大量获取β-防御素的首选方法。本实验旨在通过基因克隆和重组技术,构建猪源β-防御素2（Porcineβ-defensin 2,PBD2）的原核表达载体,体外表达、获取重组PBD2,并通过体内外试验证明重组防御素的抗菌活性,同时对其进行体内安全性评价。为防御素在临床上的研究和生产上的应用提供一定的理论依据,为进一步研发新型治疗制剂奠定基础。主要研究内容和结果总结如下:1.重组蛋白PBD2的原核表达通过Genbank获得PBD2成熟肽基因序列,根据大肠杆菌密码子的偏好性,优化PBD2的基因序列,构建p ET-32a-PBD2重组表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）p Lys S感受态细胞中,诱导重组蛋白的表达,利用SDS-PAGE及Western blot对表达的蛋白进行验证,结果显示,成功构建p ET-32a-PBD2重组表达载体,经诱导后获得重组蛋白PBD2。利用镍柱将重组蛋白进行亲和纯化,经BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化后的重组蛋白的浓度为1.5μg/μL。2.重组蛋白PBD2体外抑菌活性分析为验证重组蛋白PBD2的体外抑菌活性,选用大肠杆菌标准菌株（CMCC 44102）、沙门氏菌标准菌株（ATCC 9150）、金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923）以及猪源肠道外致病性大肠杆菌Ex-P22、Ex-P27、Ex-P30六种病原菌为指示菌株,通过微量抑菌试验表明PBD2对以上指示菌均具有抑菌活性,其中对猪源肠道外致病性大肠杆菌Ex-P22、Ex-P27、Ex-P30的最小抑菌浓度均为75μg/m L,对大肠杆菌标准菌株（CMCC 44102）的最小抑菌浓度为37.5μg/m L,对沙门氏菌标准菌株（ATCC 9150）、金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923）的最小抑菌浓度均为150μg/m L。将PBD2分别与大肠杆菌标准菌株（CMCC 44102）、金黄色葡萄球（ATCC 25923）进行共培养后制作样品,通过电子显微镜对细菌超微结构进行观察,结果显示:对照组的菌体完整,外观饱满圆润,表面光滑平直,未见菌体细胞膜穿破皱缩以及内容物外泄的现象;试验组的菌体出现了明显的皱缩且伴有细胞壁表面凹陷以及内容物外泄等明显症状。试验结果直观地展现出PBD2能破坏菌体的完整性,从而佐证了其具有抑菌活性。3.重组蛋白PBD2对BALB/c小鼠的攻毒保护试验及安全性试验为验证重组蛋白PBD2体内抑菌活性,通过猪源肠道外致病性大肠杆菌Ex-P30对小鼠的感染试验,确定小鼠对Ex-P30最适感染浓度为1×10~8CFU/m L。在感染并治疗小鼠后,对小鼠进行解剖并制作病理切片,结果表明,感染组的炎症明显,预防组有一定的炎症反应,治疗组出现轻度炎症反应,说明了PBD2对感染致病菌的小鼠具有一定的治疗效果。重组蛋白PBD2在小鼠体内接种试验观察和分析结果表明,各组小鼠行为特征无明显异常变化。与接种前相比,各实验组和对照组小鼠精神状态、活动和采食均正常,无不良反应,小鼠肾脏、心脏、肝脏、脾脏和肺脏组织病理切片观察均未出现明显的器质性病变,结果表明,本次研究表达的重组蛋白PBD2对试验鼠无明显毒副作用,具有良好的安全性。综上所述,本次研究利用大肠杆菌表达系统获得在上清高量表达的重组PBD2,验证了其对多种病原菌均具有生物学活性,通过对小鼠的接种试验,证明了该防御素对实验鼠无毒副作用,具有安全性。这对PBD2在临床上的研究和生产上的应用具有一定的参考价值。