目的随着肥胖及相关代谢紊乱性疾病的增加,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率在包括我国在内的全球多数国家呈快速递增趋势,在欧美地区NAFLD位居各种肝病首位,在我国已成为继病毒性肝炎之后的“第二大肝病”,其危害性愈加突出。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD疾病谱中的关键阶段,是单纯性脂肪肝发展为脂肪性肝纤维化和肝硬化的必经过程,然而,目前有关NASH的病理损伤机制尚未阐明,临床上缺乏特异性治疗方法。鉴于细胞凋亡是主要的细胞死亡形式之一,在多种肝病中是促进病情发展导致组织损伤的重要机制,因此细胞凋亡在NASH发生和进展病理过程中的作用和意义值得研究。本课题通过建立与人NASH病理特点具有较好比拟性的NASH大鼠模型,动态研究肝脏组织中细胞凋亡的发生特点以及调控或影响凋亡发生的相关蛋白(核酸)的表达变化,揭示细胞凋亡在NASH中发生机制,明确细胞凋亡在NASH病程进展过程中与脂变、炎症、纤维化程度的相关性,以及导致细胞凋亡发生的调控机制,为从细胞凋亡角度阐述NASH的发病和进展机制提供理论及实验依据,为NASH防治提供可能的新思路。方法采用高脂饮食建立大鼠NASH实验模型,采用常规病理、组织化学染色,结合NASH-CRN 2005年推荐的NAFLD组织学评分方案对正常组及模型组大鼠肝脏组织脂变、炎症及纤维化程度进行病理学评价与评分;采用TUNEL法动态检测正常组及大鼠NASH模型肝组织细胞凋亡状况;采用双抗体夹心ELISA法检测血清中TNF-α含量,并进行肝功能血清生化转氨酶检测;综合上述指标分析细胞凋亡与NASH肝组织病理改变及血清学指标之间关系;采用免疫组织化学、原位杂交方法在肝组织原位检测凋亡通路中关键分子Fas、FasL、Caspase-8、Cytochrome-C和Caspase-3、氧应激蛋白酶CYP2E1、相关凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2、核转录因子NF-κB、细胞增殖抗原PCNA的蛋白和(或)mRNA表达变化,探讨NASH病理过程中细胞凋亡的作用及分子调节机制。结果1、NASH模型组大鼠肝组织表现为大小泡混合性肝细胞脂肪变性、气球样变、小叶内炎症和肝窦壁细胞增生,脂质肉芽肿及凋亡小体形成等病理改变,至造模12w时,肝纤维化较明显。2、与对照组比较,凋亡肝细胞从造模2周即开始增多,至造模8周达到高峰,与NASH脂变程度及纤维化程度呈显著正相关(P<0.01),且与血清ALT、TNF-α水平具有显著相关性(P<0.01),与AST具有相关性(P<0.05)。增殖期PCNA阳性肝细胞在造模2周、4周增多不明显,但造模6周始阳性肝细胞数明显增多。3、Fas/ Fas mRNA、FasL/FasL mRNA主要见于脂变肝细胞胞浆内,Fas及配体mRNA表达于造模6周明显上调,其蛋白水平表达于造模8周显著增加;Caspase-8阳性细胞定位于肝细胞浆,其上调表达于模型8周为著;Caspase-3阳性细胞于造模2周始增加,造模6周显著增多,主要见于整个肝腺泡脂变肝细胞内;Cytochrome-C和CYP2E1阳性表达基本一致,主要定位于肝细胞,于模型2周始增多,主要分布以肝腺泡Ⅲ带为主,并随造模时间延长呈现上升态势。4、Bax阳性细胞在造模2周时增多,而Bcl-2阳性细胞明显增加始于造模4周,二者分布均以肝腺泡Ⅲ带为主,并随造模时间延长,阳性细胞数呈增多趋势,至模型12周时,于脂变明显肝细胞及脂质肉芽肿部位表达增强。两种凋亡调节蛋白比较,造型早期Bax阳性细胞均多于Bcl-2阳性细胞数,但在造模后期二者阳性细胞数趋于接近。5、NF-κB阳性表达定位于肝细胞浆和(或)核,核阳性NF-κB于模型6周显著增多,分别与细胞凋亡及增殖指标(PCNA)均具有相关性(P<0.01)。结论1、成功制备与人体NASH病理特点比拟性较好的实验性大鼠NASH模型,为NASH发病机制及药物等干预性研究提供了较好实验模型。2、肝细胞凋亡是NASH病理过程中主要的细胞损伤形式之一,NASH肝脏细胞凋亡与脂肪变性程度和纤维化程度具明显相关性,与炎症程度关系密切。NASH病理过程中早期肝细胞凋亡显著强于细胞增殖过程,但在病变后期肝细胞凋亡与增殖并存,结果提示抗凋亡干预治疗有可能减轻NASH肝组织损伤程度,进而减缓或阻止NASH病程进展。3、参与线粒体凋亡途径和死亡受体途径的多种关键性凋亡调节分子可能共同参与了NASH发生和发展过程中细胞凋亡机制,在NASH早期阶段,线粒体凋亡途径更为突出,但随着脂变和炎症程度的加重死亡受体途径亦参与了细胞凋亡过程。4、氧应激反应可能贯穿于NASH病程发生与发展过程中,并可能是导致细胞凋亡发生的始动因素,抗氧化活性治疗可能是抑制NASH细胞凋亡发生,阻止NASH进展的途径之一。