miR-199a-5p调控绒山羊毛乳头细胞增殖的分子机制研究

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绒山羊的毛囊具有周期性发育的特征,这个周期性的循环包括生长期、休止期、退行期三个阶段,而毛乳头细胞是毛囊发育的关键信号和组织中心。miRNA对绒山羊毛囊生长发育过程中的相关基因表达具有显著的调控作用。通过对课题组前期绒山羊皮肤组织miRNA测序的结果进行生物信息学分析显示,miR-199a-5p在休止期皮肤组织中的表达量显著高于生长期,并且miR-199a-5p已被报道能够抑制皮肤角质形成细胞、血管内皮细胞等的增殖,但其在绒山羊毛乳头细胞中的作用还未可知。因此本研究以绒山羊毛囊毛乳头细胞为研究对象,通过过表达/抑制miR-199a-5p,利用MTT和Ed U试验检测其对毛乳头细胞增殖的影响,并通过检测增殖相关基因的表达情况进一步验证,然后对其调控机制进行研究,获得了以下主要结果:1.利用MTT、EdU对miR-199a-5p在毛乳头细胞中的功能研究表明,与对照组相比,过表达miR-199a-5p后毛乳头细胞的存活能力显著降低(P<0.01),而在抑制miR-199a-5p表达后,其存活能力显著升高(P<0.01);Ed U结果表明miR-199a-5p过表达后Ed U阳性细胞的比例显著低于对照组,而抑制其表达后阳性细胞数量相对于对照组显著增加。过表达miR-199a-5p后,增殖相关基因PCNA、C-Myc等的表达量显著降低,表明miR-199a-5p能够抑制毛乳头细胞的增殖。2.对miR-199a-5p与VEGFA的靶向关系研究表明,过表达miR-199a-5p后,VEGFA基因的海肾荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性的比值显著低于对照组,而抑制miR-199a-5p后,这一比值则显著高于其对照组。而突变VEGFA基因的靶向结合位点后,其相对酶活比值差异不显著,说明miR-199a-5p通过靶向VEGFA 3’UTR区调控其表达。q RT-PCR、Western blot试验和细胞免疫荧光试验也进一步验证了VEGFA为miR-199a-5p的靶基因。3.构建VEGFA腺病毒过表达载体,与miR-199a-5p mimics共转毛乳头细胞进行恢复试验,结果显示,过表达VEGFA基因后促进毛乳头细胞的增殖,这一作用与miR-199a-5p的作用相反,进一步说明miR-199a-5p通过靶向VEGFA基因的表达而抑制绒山羊毛乳头细胞的增殖。本研究揭示了miR-199a-5p在绒山羊毛乳头细胞增殖中的作用及其调控机制,为揭示绒山羊毛囊周期性发育的分子机制提供了理论依据。
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