研究目的:在胚胎时期胎肝是主要的造血器官。出生后,骨髓成为主要的造血位点。在某些病理条件下,由于骨髓造血功能衰竭,肝脏等实质器官可以发生髓外造血,提示成年肝脏中含有造血干祖细胞,具有长期造血重建的能力。然而,对于成年肝脏造血的特点、肝脏造血干祖细胞的发育来源、肝脏造血微环境的组成以及肝脏微环境对肝脏造血的具体调节机制尚不清楚。在本研究中,我们首先采用造血干细胞最经典的标志lineage-sca-1+c-kit+(LSK,包含造血干细胞和多潜能祖细胞),检测到成年小鼠肝脏中存在造血干祖细胞。进一步发现成年肝脏中存在一群与胚胎肝脏相似而不同于骨髓的CD45+lineage-mac-1+sca-1+(LMS)细胞。通过造血干细胞移植实验,我们观察到肝脏LSK细胞和LMS细胞均可分化为成熟的淋巴细胞和髓系细胞。与骨髓来源的造血干细胞相比,肝脏LSK细胞和LMS细胞更倾向于分化为T淋巴细胞。我们进一步探讨了肝脏微环境中促进肝脏造血和T淋巴细胞分化的因素。一方面,我们发现肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞可以促进成年肝脏LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化,且以T淋巴细胞和B淋巴细胞分化为主。通过共培养实验证实,阻断Kupffer细胞上的细胞间粘附分子-1(ICAM-1),可降低LSK细胞的黏附、增殖和分化。这些结果提示Kupffer细胞在维持和促进成年小鼠肝脏造血方面具有重要作用。另一方面,我们进一步证实了成年肝脏造血干细胞具有一群不同于骨髓的具有造血功能的LMS细胞。肝窦内皮细胞作为肝脏造血微环境的重要组成部分,可以通过Notch信号促进肝脏LMS细胞的分化,且以T淋巴细胞分化占优势。这些发现为了解肝脏髓外造血及其意义提供了重要的见解,为肝脏驻留免疫细胞的发育分化及肝脏疾病{如肝炎、非酒精性脂肪肝(NAFLD)和肝细胞癌(HCC)}的治疗等提供了一定的启示。研究方法:1.通过流式细胞术检测并比较了不同器官中肝脏造血干祖细胞(LSK和LMS)的比例。2.通过甲基纤维素半固体培养实验分析了肝脏造血干祖细胞的集落形成能力。3.采用多色流式细胞术分选肝脏或骨髓的造血干祖细胞,将CD45.2+小鼠的肝脏或骨髓造血干祖细胞与CD45.1+小鼠的骨髓单个核细胞混合,通过尾静脉注射到致死量照射的CD45.1+的小鼠体内,在不同时间点检测受者小鼠外周血中CD45.2+细胞、淋巴细胞及髓系细胞的比例,以确定成年肝脏造血干祖细胞的造血重建能力。4.通过LPS诱导的小鼠髓外造血模型来促进成年肝脏造血。5.采用氯磷酸二钠脂质体清除巨噬细胞和Kupffer细胞,观察清除Kupffer细胞之后对肝脏髓外造血的影响。6.通过ELISA方法检测Kupffer细胞分泌的造血生长因子及促炎因子的表达水平。7.采用共培养实验和流式细胞术在不同时间点检测肝脏造血干祖细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化的情况。8.通过流式细胞术检测Kupffer细胞上ICAM-1和VCAM-1表达的变化及其相应配体LFA-1和VLA-4在肝脏LSK上表达的情况。9.在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中加入ICAM-1阻断抗体,采用流式细胞术检测共培养体系中分化的淋巴细胞和髓系细胞的比例。10.通过实时荧光定量PCR检测了肝脏微环境造血调节因子及肝窦内皮细胞上Notch配体基因水平的表达情况。11.通过流式细胞术检测肝脏LMS细胞上Notch受体Notchl及Notch2的表达情况。12.通过流式细胞术检测了共培养体系中LMS细胞上Notch的活化形式NICD的表达情况。13.在肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养体系中加入Notch信号抑制剂,通过流式细胞术观察肝脏LMS向淋巴细胞分化的情况。实验结果:1 Kupffer细胞促进肝脏造血机制研究1.1成年肝脏中含有造血干祖细胞通过流式细胞术检测并比较了不同发育阶段小鼠肝脏和骨髓中LSK细胞的比例。观察到成年肝脏中仍存在少量的LSK细胞。利用甲基纤维素半固体培养实验,发现虽然肝脏LSK细胞形成GM-CFU和M-CFU集落的数量明显低于骨髓,但是成年肝脏LSK细胞仍具有形成GM-CFU和M-CFU集落的能力。提示成年肝脏中存在具有造血功能的造血干祖细胞。1.2成年肝脏LSK细胞能够生成淋巴系和髓系细胞利用造血移植实验,观察到肝脏来源的LSK细胞能够重建致死量照射小鼠的淋巴细胞和髓系细胞,但是肝脏来源的LSK细胞的造血重建能力明显弱于骨髓。与骨髓相比,来源于肝脏的LSK细胞优先分化为T淋巴细胞,骨髓来源的LSK细胞主要以生成B淋巴细胞为主,产生较少的T淋巴细胞。并且发现肝脏来源的LSK细胞,主要是在肝脏中进一步分化为淋巴细胞和髓系细胞,却很少迁移到骨髓。然而,骨髓来源的LSK细胞可以同时迁移到骨髓和肝脏。1.3 Kupffer细胞促进LPS诱导的肝脏髓外造血连续3天给小鼠腹腔注射LPS建立髓外造血模型。采用流式细胞术检测肝脏中LSK细胞和长期造血干细胞(LT-HSC)的数量。发现与对照组相比,LPS处理组小鼠肝脏中LSK和LT-HSC细胞的绝对数显著增加。这提示LPS可以诱导肝脏髓外造血。利用氯磷酸二钠脂质体清除Kupffer细胞可明显削弱LPS诱导的肝脏LSK细胞和LT-HSC的数量增加。这说明Kupffer细胞在LPS诱导的肝脏髓外造血中发挥重要作用。1.4 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞分化为淋巴细胞和髓系细胞通过Kupffer细胞与LSK细胞共培养实验,观察到当只有培养基和SCF细胞因子的存在时肝脏LSK细胞不能分化为淋巴细胞和髓系细胞,只有当共培养体系中有Kupffer细胞的存在时肝脏LSK细胞才能分化为淋巴细胞和髓系细胞,如果在共培养体系中同时加入LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。这就提示Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的分化。1.5 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞的增殖利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,观察到与PBS对照组相比,LPS处理组增加肝脏Ki-67+LSK细胞的比例,而清除Kupffer细胞显著降低了 LPS处理组肝脏Ki-67+LSK细胞的比例。说明Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的增殖。1.6 Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,采用流式细胞术检测了 Kupffer细胞表面黏附分子的表达。发现与对照组相比,LPS处理组ICAM-1的表达显著增加,但VCAM-1的表达没有改变。进一步检测了肝脏LSK细胞上ICAM-1和VCAM-1的相应配体LFA-1和VLA-4的表达情况。发现LPS处理之后肝脏LSK细胞上LFA-1的表达显著升高,而VLA-1的表达没有变化。在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中,用抗体阻断ICAM-1与LFA的相互作用,无论是造血干祖细胞(LSK细胞和谱系阴性细胞),还是分化的CD3+T细胞和CD19+B细胞数量都有所下降。提示Kupffer细胞可以通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化。2肝窦内皮细胞促进肝脏造血的机制研究2.1成年肝脏存在一群不同于骨髓的LMS细胞采用流式细胞术检测了胎肝、成年肝脏、脾脏及骨髓中LMS细胞的比例,并通过造血移植实验验证了胎肝LMS细胞的造血重建能力,观察到胎肝中确实存在LMS细胞并且具有造血功能,成年肝脏也存在较高比例的LMS细胞。但是,在脾脏和骨髓中几乎检测不到LMS细胞。提示LMS细胞可能仅存在于胎肝和成年肝脏,成年肝脏存在的LMS细胞可能来源于胚胎肝脏,而非骨髓。2.2成年肝脏中LMS细胞来自于胎肝给致死量照射小鼠分别转输胎肝和骨髓单个核细胞,在转输后第4周检测CD45.2+受体小鼠肝脏中供体来源的(CD45.1+)LMS细胞的生成情况。发现胎肝来源的单个核细胞在转输后4周能够在受体鼠肝脏中重建LMS细胞,但是骨髓来源的单个核细胞不能进行重建。进一步检测转输胎肝单个核细胞后受体鼠各个器官中LMS细胞重建情况,我们发现胎肝单个核细胞只能在肝脏中重建LMS细胞,而在骨髓、脾脏、外周血中几乎检测不到。这提示成年肝脏LMS细胞是来源于胎肝,而不是骨髓。2.3成年肝脏LMS细胞能够向淋巴系和髓系细胞分化给致死量照射小鼠转输成年肝脏LMS细胞,4周后能够在受体鼠外周血中检测到供体来源的CD45.1+LMS细胞,并且一直持续到第7周。进一步在受体鼠的肝脏、脾脏及骨髓中都观察到供体来源的CD45.1+的细胞,并且在受体肝脏中检测到供体来源的细胞可以分化发育为淋巴系(CD3+T、CD19+B、NK1.1+NK细胞)及CD11b+髓系细胞,但主要以CD3+T细胞为主。这说明成年肝脏LMS细胞能够向淋巴细胞和髓系细胞分化。2.4肝窦内皮细胞促进肝脏LMS细胞分化成淋巴细胞及髓系细胞通过肝窦内皮细胞与LMS细胞共培养实验,观察到肝窦内皮细胞能够促进LMS细胞分化成CD3+T、CD19+B、+NK1.1NK淋巴细胞和CD11b+髓系细胞,并且主要以生成CD3+T细胞为主。提示肝窦内皮细胞对LMS细胞的分化具有促进作用。2.5肝窦内皮细胞通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化将肝窦内皮细胞(LSEC)单独或肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养(LSEC+LMS),比较肝窦内皮Notch配体Jag1、Jag2、DLL1和DLL4基因表达水平。发现单独培养组和共培养组中肝窦内皮细胞都表达Jag1、Jag2、DLL1和DLL4,LSEC+LMS组与LSEC组相比DLL1的表达有所升高,Jag1和DLL4的表达没有差异,Jag2表达有降低的趋势。这就暗示肝窦内皮细胞有可能是通过Notch信号来促进了 LMS细胞向CD3+T细胞的分化。进一步检测LMS细胞上Notch受体Notch 1及Notch2的表达情况,发现LMS细胞表达一定比例的Notch 1及Notch2。随后我们检测了肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养中分化的淋巴细胞的比例。我们观察到Notch抑制剂LY411575处理组与对照组相比,共培养体系中造血祖细胞Lin-细胞比例下降,分化的CD3+T细胞的比例下降,而CD19+B细胞的比例升高。这些表明肝窦内皮细胞是通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化。结论及意义:1.成年肝脏中存在LSK细胞和肝脏特有的不同于骨髓的LMS细胞。2.肝脏LSK细胞和LMS细胞具有向淋巴细胞和髓系细胞分化的能力,且以向T淋巴细胞分化占优势。3.本研究首次发现,在LPS诱导的肝脏髓外造血模型中,Kupffer细胞对LSK细胞的增殖具有促进作用。Kupffer细胞能够促进LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,且以向T和B淋巴细胞分化为主,LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1的相互作用促进LSK细胞在肝脏的驻留、增殖和分化。4.肝窦内皮细胞可以促进LMS细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,主要以向T淋巴细胞分化为主,肝窦内皮细胞通过Notch信号促进LMS细胞向T淋巴细胞的分化。