小分子化合物包含的物质种类十分广泛,如生物体内的氨基酸、糖与核苷酸等,天然存在的各种真菌毒素、维生素,以及应用于现代行业的各种人工合成的小分子等。在这其中,许多物质是人类日常生活以及生态环境中的有毒物和污染物,其高度渗透于人类生活的各个方面,显然已经演变成了全球性的公共卫生问题,如何对它们实现方便快捷的检测是一项值得研究的课题。目前大多数小分子的检测是通过如高效液相色谱（HPLC）与气相色谱（GC）等经典色谱法来实现的,具有较高的灵敏度与特异性,但是这些方法经常需要大型仪器的辅助以及专业人员操作,不具备现场快速筛查的潜力,而生物传感器作为快速发展中的一类检测手段,面对不同目标物已经分别实现了实时输出、高特异性、快速以及微量样本的检测,打破了传统方法的一些限制,更易于大范围的推广和应用。其中,转录因子作为一种新型的小分子识别生物工具,在近年来得到了分析化学领域的关注,人们利用其识别目标小分子后的离去性质设计了新型的传感装置,并且还利用蛋白质工程中的方法对转录因子本身进行改造,使其能够识别除野生型配体以外的小分子物质,扩大了目标物的范围,有利于转录因子在生物传感领域中的进一步应用。基于转录因子的分子识别功能,借助T7 RNA聚合酶与Cas12a蛋白这两种信号放大系统,我们设计了两种小分子识别生物传感平台,旨在实现一种在转录因子识别范围内的,快速的小分子识别通用型方法。为此,我们开展了以下工作:1、TetR转录因子以及Cas12a蛋白的原核系统表达纯化与基本活性的验证。TetR转录因子可结合一段特定的双链DNA序列,并可在其上形成二聚体。我们利用凝胶电泳分析法确定了自行表达的TetR转录因子具有与双链DNA结合的活性。随后,我们又对其响应四环素的活性进行了验证,并观察到浓度依赖型的释放效应。最后,我们发现DNA双链的长度不会对二者的结合效应产生影响,这对于设计生物传感装置具有一定的指导意义。基于课题组之前的探究,我们还对Cas12a蛋白的sg RNA结合,特异性切割及非特异性切割活性进行了基本的验证,确保其功能正常,为后续的实验奠定基础。2、构建基于转录因子与T7 RNA聚合酶的小分子生物传感平台。T7 RNA聚合酶转录过程的开启需要首先识别一段启动子序列,随后沿着下游方向进行。利用TetR与双链DNA结合后的位阻效应,我们设计了一种针对四环素响应的开关装置,以聚合酶转录出的RNA适配体Pepper与其对应的染料分子HBV结合后发出的荧光信号作为输出,构建了一种小分子生物传感平台,并解决了该平台在识别过程中存在的问题,最终以分步法的方式实现检测,随后表征了该传感平台的基本性能,最终我们还成功将检测结果进行可视化的输出。3、构建基于转录因子与Cas12a的小分子生物传感平台。面对前一章节中构建的传感平台仍然存在的不足,我们借助Cas12a作为信号放大装置来对其进行了解决。同样利用空间位阻的作用,我们设计了三种不同的双链目标物,分别具有不同位置与数量的TetR结合位点。在TetR存在的情况下阻碍Cas12a识别PAM序列,挑选出三者中阻碍效果最佳的一组,从而设计出另一种针对四环素响应的开关装置,由在四环素存在情况下释放出的双链目标物激活Cas12a的非特异切割活性,在该性质下被降解的Reporter序列释放出标记有FAM基团的ss DNA碎片,以荧光信号的方式将检测结果输出。随后,我们对该反应体系中使用的蛋白及目标物用量进行优化,以实现最佳的检测效果,同样对其进行常规检测性质的表征,相较于T7 RNA聚合酶的生物传感体系,基于Cas12a与转录因子构建的生物传感体系具有更短的反应时间与更简便的操作,同时还具有更优良的线性校准曲线,并且同样可以实现可视化的检测结果输出。