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目的:目前临床上依靠细菌培养和传统分子技术检测细菌性脑膜炎(Bacterial Meningitis,BM)感染细菌的方法通量低、灵敏度低、阳性率低而且耗时长,影响了患者最佳治疗方案的选择。并且近期研究发现,细菌性脑膜炎患者脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)中有多种细菌共存[1]。因此,本研究目的是使用一种不依赖于细菌培养的细菌检测新方法,即利用新一代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)来检测BM患者所感染的细菌或菌群,并分析菌群丰度、菌群构成和菌群多样性,为诊断BM患者所感染的细菌提供理论依据。同时,本研究针对临床上一些含菌量少的微量样品来优化一套有效提取其微量DNA的方法,使其能达到常规测序的要求,为后期生物信息分析提供更多的数据,并尽可能多的获得细菌相关信息。方法:首先,本研究先使用微量“模拟脑脊液”样本进行DNA提取方法的建立。微量DNA提取方法的建立主要通过以下试验:一是对均适合提取CSF中基因组DNA的QIAamp(?)DNA Mini Kit 和 QIAamp(?)DNA Microbiome kit 两种试剂盒进行选择,二是对细菌裂解时间的摸索,三是分析乙醇沉淀核酸载体对微量DNA提取效果的影响。其次,再使用8例细菌培养呈阳性的BM患者的CSF进行DNA提取及高通量测序检测细菌来验证前期优化的DNA提取方法的可行性和实用性。最后,选用31例临床诊断为BM患儿的CSF按照我们建立的微量DNA提取方法进行DNA提取、基因文库构建,进而在Ion Torrent PGM高通量测序平台上利用16S rDNA基因组测序技术进行测序,根据测序结果来分析CSF中感染的细菌种类,菌群丰度,菌群构成和菌群多样性。结果:对临床培养呈阳性的CSF进行DNA提取及高通量测序检测细菌来验证前期建立的DNA提取方法,其结果为:16S rDNA测序检测的细菌与临床细菌培养检测的细菌基本一致,说明建立的微量DNA提取方法具有实用性,也进一步说明高通量测序在BM细菌检测中的可行性。对31例BM患者感染的细菌进行检测分析:在门分类水平上总共检测出55种细菌菌群,在属分类水平上总共检测出596种细菌菌群。其中,以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭杆菌门为主,优势菌属以链球菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、消化链球菌属、不动杆菌属、普雷沃氏菌属、奈瑟氏菌属和流感嗜血杆菌属为主,这表明:细菌性脑膜炎患者CSF中感染的细菌并非只由单种细菌或某几种细菌菌群组成,其感染机制可能是多种细菌协同作用的结果。由Alpha多样性的Shannon指数和Simpson指数分别约为6.802和0.954可以说明这些CSF样本中的物种多样性偏低,细菌种类的复杂度不高。由Beta多样性相关指标分析可知不同患者感染的细菌种类、菌群丰度和菌群构成存在明显的地域性差异。结论:本研究优化改进的有效提取微量CSF基因组DNA及建库测序的方法能对临床上细菌性脑膜炎患者感染的细菌菌群进行准确检测,为临床细菌性脑膜炎患者脑脊液中感染细菌谱的临床诊断提供理论依据。研究还发细菌性脑膜炎患者CSF中感染的细菌并非只由单种细菌或某几种细菌菌群组成,其感染机制可能是多种细菌协同作用的结果,且细菌性脑膜炎患者脑脊液中细菌感染谱的改变具有地域性差异。