【摘 要】
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黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)是参与机体内嘌呤代谢的关键酶,研究发现XOD在机体内的病理过程中也起到了重要作用。本试验参照GenBank中收录的G.gallus XOD基因序列(D1
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黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)是参与机体内嘌呤代谢的关键酶,研究发现XOD在机体内的病理过程中也起到了重要作用。本试验参照GenBank中收录的G.gallus XOD基因序列(D13221.1)设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增一段XOD亚基序列(987 bp),通过基因克隆,将目的基因插入到PMD-18-T载体上。确定正确插入后,将酶切后的目的基因连接至pET-32a(+)载体,构建鸡XOD原核表达载体pET-XOD,并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,诱导表达重组鸡XOD蛋白。通过镍柱亲和层析的方法纯化重组鸡XOD蛋白,以复性浓缩后的重组鸡XOD蛋白作为抗原制备抗体血清,使用间接ELISA和Western blot的方法分别确定抗体的效价和特异性。通过利用免疫组化和免疫荧光的方法,使用本试验中制备的多克隆抗体,定位鸡XOD在肝、肾组织中的分布。通过利用Western blot相对定量蛋白的方法,检测鸡在感染肾型传染性支气管炎(NIBV)后肾组织中XOD和Bcl-2蛋白表达量的变化。结果表明:鸡XOD原核表达系统构建成功,并分离纯化到了高浓度的重组鸡XOD蛋白(大小约54 KDa)。用该蛋白制备的多克隆抗体效价约1:102400,可特异性地检测鸡肝组织中的XOD。免疫组化和免疫荧光检测结果显示鸡XOD主要存在于肝、肾组织细胞胞质之中。同时,蛋白定量结果表明在鸡NIBV感染后会引起肾组织中XOD和Bcl-2的蛋白表达量的显著上升(P<0.05)。本试验通过构建体外高效表达XOD蛋白的方法,获得了纯度较高的重组鸡XOD蛋白。并用表达的重组鸡XOD蛋白制备了多克隆抗体,且使用此抗体定位了XOD在鸡肝、肾组织中的分布及NIBV感染后的肾组织中XOD蛋白表达量分析,为进一步揭示鸡NIBV感染后的病理机制提供了理论依据。
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