论文部分内容阅读
目的:目前,氡及其子体作为Ⅰ类致癌因素,已成为诱发肺癌的第二大原因,仅次于吸烟。关于氡的研究主要集中在环境氡浓度检测和相关的流行病学调查,而动物实验与分子机制研究仍然缺乏。本研究通过氡及其子体吸入染毒的动物模型、人永生化支气管上皮细胞（BEAS-2B）氡染毒和线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）缺失的BEAS-2B细胞氡染毒模型,研究氡及其子体致小鼠肺组织和BEAS-2B细胞线粒体损伤及细胞线粒体敲减后相关指标的变化情况,探讨氡及其子体对细胞线粒体的损伤在氡致肺癌中的作用。方法:（1）动物氡染毒模型:6～8周龄雄性BALB/c小鼠,分为对照组和氡染毒组（3、6、9个月组）,染毒组染氡浓度为50000 Bq/m3,每天染毒8 h,一周染毒6天,分别染氡至3、6、9个月。（2）BEAS-2B细胞氡染毒模型:对BEAS-2B细胞经气体暴露进行氡染毒处理,每次染氡浓度为20000 Bq/m3,染氡时间为20 min,染氡1次作为染氡1代记为Rn-1,重复染毒40次,取其中第5、10、20、30、40代细胞用于后续实验,即Rn-5、Rn-10、Rn-20、Rn-30和Rn-40;未染毒细胞作为对照组,记为Rn-0。（3）溴化乙锭（Ethidium bromide,EB）诱导法建立mtDNA缺失的BEAS-2B细胞氡染毒模型,对正常组和线粒体敲减组的BEAS-2B细胞同时进行染氡处理,每次染氡浓度为20000 Bq/m3,染氡时间为20 min,染氡1次作为染氡1代记为Rn-1,重复染毒25次,取其中Rn-0、Rn-5和Rn-10进行后续实验。（4）采用实时荧光定量PCR（Realtime-qPCR）测定细胞mtDNA的减少情况;通过PCR和Western Blot检测小鼠肺组织和BEAS-2B细胞自噬相关基因和氧化应激相关蛋白的表达情况（5）采用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、活性氧检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒和总SOD活性检测试剂盒（WST-8法）检测细胞线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活性。结果:第一部分:病理检查发现,染氡小鼠肺组织呈病理性改变,主要表现为肺泡壁破碎、肺泡间隔增厚和肺泡腔萎缩。蛋白分析,染氡3个月和9个月时,与对照组相比,抗氧化相关蛋白Nrf-2的表达量增加,其下游蛋白HO-1和NQO-1蛋白的相对表达量在染氡3、6、9个月时也均明显高于对照组（P＜0.01或P＜0.05）。同时,与对照组相比,抗氧化蛋白TRX-1的表达量在染氡第3和第9个月时均明显降低,在第6个月时明显增加（P＜0.01）,而TRX-1的抑制蛋白TXNIP的表达量在三组中均明显降低（P＜0.01）。进一步检测肺组织自噬相关基因的表达情况,发现相较于未染氡的对照组,线粒体自噬标志基因PINK-1和Parkin的表达水平在染氡3、6、9个月时均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。在自噬成膜阶段,与对照组相比,Beclin-1基因的表达水平在染氡3、6、9个月时均升高,自噬体形成所需的关键蛋白ATG-7和ATG-5基因的表达水平也均升高。作为监测自噬通量的标志基因,LC3B基因的表达水平在染氡第3和第6个月时高于对照组,p62基因的表达水平在染氡第3和第6个月时低于对照组,提示我们此时自噬处于激活状态,且自噬流通畅;在染氡第9个月时,LC3B和p62基因的表达水平均高于对照组,此时p62积累,自噬体与溶酶体结合可能受阻,出现自噬流阻断。第二部分:BEAS-2B细胞氡染毒后,电镜下可见细胞线粒体受损,表现为线粒体肿胀,局部膜破损,嵴扩张,并且有较多自噬溶酶体。针对线粒体受损,我们测定了氧化应激的相关指标,发现氡暴露可以导致BEAS-2B细胞受到的氧化损伤,表现在与对照组比较,染氡后BEAS-2B细胞MMP水平明显下降（P＜0.01）,ROS水平明显升高（P＜0.01）,细胞的抗氧化指标总SOD水平也降低。抗氧化蛋白Nrf-2除Rn-5和Rn-20外,其他组相较于对照组表达量均升高,下游蛋白HO-1和NQO-1的表达量也高于对照组。线粒体受损后细胞内可见自噬溶酶体,提示我们有自噬发生。线粒体自噬标志基因PINK-1和Parkin基因的表达水平在Rn-5时均高于对照组,随着染氡时间的增加,PINK-1和Parkin基因的表达水平逐渐降低,最终低于对照组,但在Rn-40时,PINK-1和Parkin的表达水平高于对照组。在Rn-5时,p6和LC3B基因的表达水平均高于对照组,此时可能发生自噬流阻滞,但随着染氡代数的增加,自噬被进一步激活,p62基因的表达水平均明显低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）,LC3B基因的表达水平除Rn-20外也均明显高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。第三部分:正常组和线粒体敲减组的BEAS-2B细胞氡染毒后,发现适当降低细胞内线粒体的数量,可以降低氡及其子体对线粒体造成的损伤,包括氧化损伤和自噬。首先,正常组细胞的mtDNA拷贝数相较于对照组增加,而线粒体敲减组的mtDNA拷贝数相较于正常组明显降低（P＜0.01）。相较于各自的对照组Rn-0,正常组细胞的MMP降低,线粒体敲减组的MMP升高,但敲减组MMP值各组均低于正常组（P＜0.01）。其次,线粒体敲减组细胞的抗氧化水平得到改善,表现在敲减组除Rn-5外的ROS水平和总SOD水平均低于正常组,反映脂质氧化水平的MDA含量也均低于正常组,抗氧化蛋白Nrf-2的表达量,线粒体敲减组低于正常组,但差异没有统计学意义,HO-1和NQO-1的表达量,线粒体敲减的部分组低于正常组。最后,线粒体敲减组的线粒体自噬标志基因PINK-1和Parkin,自噬相关基因Beclin-1、ATG-12、ATG-5和p62基因的表达水平均明显低于正常组（P＜0.05或P＜0.01）,而LC3B基因的表达水平明显高于正常组（P＜0.01）。结论:1.氡及其子体导致小鼠肺组织受损,小鼠肺组织抗氧化蛋白的表达升高,自噬相关基因的表达上调;2.通过氡染毒的BEAS-2B细胞模型,观察细胞的MMP、ROS、MDA、SOD的水平,以及氧化应激相关蛋白和自噬相关基因的表达等相关指标,发现氡及其子体可能通过氧化应激途径诱导细胞线粒体损伤,并诱发自噬;3.通过EB诱导法成功构建了 mtDNA部分缺失的BEAS-2B细胞模型,并对细胞进行氡染毒处理。发现适当降低细胞内线粒体的数量,可以改善氡及其子体对线粒体造成的损伤,包括氧化损伤和自噬,特别是PINK-1-Parkin介导的线粒体自噬。