先天性心脏病(Congenital heart disease，CHD)，简称先心，是围产儿最常见的出生缺陷。世界范围内先心的发病率在足月、活产的新生儿约为0.80％，在成年人中约为0.40％，其中散发型非综合征型先心患者占绝大多数。我国卫生部2012年9月发布的《中国出生缺陷防治报告》数据显示，我国围产期先心发病率呈快速上升趋势，每年新增病例18万～22万。　　心脏发育经历了心管形成、环化、内部分隔、血管连接等过程，任何环节遭到干扰都可能引起先天性缺陷。流行病学研究显示，尽管环境危险因素与先心发病有关，但在致病过程中发挥主导作用的是遗传危险因素。先心的表型复杂多样，临床亚型多达几十种，其病因机制存在明显的异质性。本课题组对先心复杂的遗传危险因素如单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）等进行了一系列研究。但目前，针对先心开展的全基因组关联研究(Genome-wideAssociation Studies，GWAS)还未有报道。　　近年来，GWAS已经逐渐成为人们探究常见复杂性疾病遗传易感性的有力“武器”，它的优势在于不基于任何病因假设，不局限于已知基因/通路，能够将研究范围扩大到整个基因组的遗传变异，可为先心遗传易感因素研究提供新的线索。基于多阶段病例-对照研究设计，我们首次在中国人群中开展先心GWAS研究，对大样本人群全基因组SNPs进行扫描，继而在独立病例-对照样本中进行多阶段验证，探究与中国人群先心发病风险相关的常见易感位点。为了控制遗传异质性的影响，鉴别真正的遗传危险因素，本研究选择先天性心脏间隔缺损患者作为主要研究对象，包括房间隔缺损(Atrial septal defects，ASD)、室间隔缺损(Ventricular septal defects，VSD)及房间隔缺损合并室间隔缺损(ASD/VSD)。在此基础上，我们还对由于频率较低或效应微弱未能被GWAS阐明的部分位点进一步扩大样本验证，以期发现更多与先心发病风险显著相关的常见遗传变异。　　本研究作为首个在中国人群中开展的先心GWAS，将有助于我们发现新的中国人群遗传易感位点，提示易感基因及通路，为先心的分子生物学研究提供线索;新发现的易感位点能够增加人们对先心遗传贡献的认知，完善先心遗传易感图谱;此外，还有望将新发现的标志物用于遗传学咨询，预测人群子代先心患病风险，筛查子代先心高危人群，并为早期诊断和治疗提供数据支持。　　第一部分中国汉族人群先天性心脏病全基因组关联研究　　近年来，全世界范围内先心发病率不断攀升，已经成为最常见的出生缺陷，严重影响人类生命健康。既往研究表明，先心作为一种复杂性疾病，是由环境因素与个体遗传因素共同决定的，其中遗传因素发挥主导作用。研究者们对先心遗传易感性的研究多基于候选基因策略，并且仅有少数已知致病基因上的少数遗传变异被发现与先心发病风险有关。关于先天性心脏病的GWAS研究目前还尚未有相关报道。因此，开展先心GWAS将有望帮助人们发现更多中低外显度的先心常见遗传易感位点。　　本研究运用高通量分型平台—Illumina HumanOmniZhonghua-8全基因组基因分型芯片，对945名明确诊断为散发型非综合征型先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及1246名来自同一地区、无出生缺陷和心脏疾病的对照进行了全基因组常见遗传变异检测。经过严格的质量控制，我们我们运用logistics回归中的相加模型对708275个合格SNPs进行了关联分析。8个SNPs在病例和对照中差异显著（关联研究中P≤1×10-5为验证标准）进入后续三阶段独立样本验证，验证平台采用Taqman基因分型平台。第一、第二阶段验证样本为来自南京和西安地区的2160名先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及3866名对照。结果显示，rs2474937在两阶段验证中均显示出与先心发生风险显著相关，与初筛一致，其突变基因型[C]显著增加先心发生风险（第一阶段:OR=1.35，P=9.97×10-5;第二阶段:OR=1.27，P=9.97×10-5）。rs1531070在先心病例和对照中的频率也表现出显著差异，其突变基因型[A]与先心发生风险增加显著相关（第一阶段:OR=1.29，P=2.70×10-4;第二阶段:OR=1.36，P=2.32×10-3）。进入验证阶段的其余6个、 SNP(rs17019472，rs10182004，rs9461938，rs72759270，rs9533839和rs9533839)的基因型与发病风险无显著关联(P＞0.05)。合并初筛及第一、二阶段验证所有样本后分析显示，两个阳性SNPs的变异等位基因型分别显著增加先心的发病风险至1.40倍，并且均达到GWAS研究统计学显著水平(rs2474937P=8.44×10-10，rs1531070 P=4.99×10-12)。为了探究其他先心亚型中SNP的关联情况，我们特别纳入了1180名除了ASD、VSD及ASD/VSD外的其他先心亚型来进行第三阶段验证。结果显示，两个SNPs与其他亚型先心发生风险也显著相关(rs2474937 OR=1.32,P=2.00×10-3; rs1531070 OR=1.20,P=1.40×10-2)。我们进一步根据先心不同亚型进行分层分析。本研究中纳入的先心患者主要亚型有4种—ASD、VSD、ASD/VSD以及PDA。结果发现这两个SNPs与四种先心的关联强度类似，OR介于1.30至1.58之间，并且亚组间异质性分析没有发现显著异质性（rs2474937的异质性检验P=0.546;rs1531070的异质性检验P=0.428）。　　综上所述，本研究鉴定了位于1p12和4q31.1的中国人群先心易感区域，填补了先心GWAS研究数据的空白，发现的遗传易感位点可为先心的早期筛查提供候选标志物。　　第二部分中国汉族人群先天性心脏病全基因组关联研究扩大验证　　如第一部分所述，本课题组开展了首个中国人群先心GWAS研究，采用大样本、多阶段病例-对照研究设计，发现了2个中国人群易感区域—1p12和4q31.1区域。与此同时，英国的纽卡斯尔大学Cordell等人在高加索人群中开展了先心GWAS研究，发现了与欧洲人群ASD和法洛四联症(Tetralogy of Fallot，TOF)发生风险显著相关的常见遗传变异。这些GWAS研究为进一步探索先心分子生物学机制提供了非常有价值的线索。　　然而，GWAS研究一般仅选择少数关联P值最小的峰值SNPs进行后续验证，在降低假阳性的同时可能遗漏了大最效应较弱的易感位点和（或）区域，因此每个GWAS研究均只鉴别到少数遗传易感位点，能够解释的遗传力非常有限。为了发现更多的易感位点和（或）区域，我们降低筛选标准，扩大验证范围，对全基因组关联分析中P值1.0×10-4-1.0×10-5的45个候选SNPs进行验证。第一阶段验证采用Sequenom MassARRAY分型平台，验证人群为来源于南京的2270名先心(ASD，VSD，ASD/VSD)患者及3911名对照。4个SNPs与先心发生风险有显著关联—rs1400558，rs7863990和rs490514的变异基因型均能够显著增加先心发生风险(rs1400558 OR=1.13，P=1.18×103; rs7863990 OR=1.20，P=3.00×10-3;rs490514 OR=1.15，P=8.75×10-5)，而rs2433752的变异基因型与先心风险降低有显著关联（OR=0.86，P=8.31×10-4）。其余41个SNPs基因型频率在病例和对照中的差异没有统计学意义。对4个显著关联SNPs进行第二阶段验证，纳入来自西安的1095例ASD、VSD以及ASD/VSD患者及2379名非先心对照。基因分型采用Taqman分型平台，结果显示验证的4个SNPs都与先心发生风险显著相关（P≤0.05），并且效应方向与初筛及第一阶段验证保持一致(rs1400558 OR=1.15，P=9.11×10-3; rs7863990 OR=1.28,P=6.30×10-3; rs2433752 OR=0.79，P=4.68×10-4;rs490514 OR=1.16，P=5.33×10-3)。此外，我们纳入来自南京和西安的2188名除ASD、VSD以及ASD/VSD外的其他类型先心患者和来自于同地区的1120名非先心对照作为第三阶段验证人群，结果表明这4个SNPs也与其他亚型先心发生风险显著相关(rs1400558 OR=1.18，P=2.91×10-3; rs7863990 OR=1.45，P=1.76×10-5; rs2433752 OR=0.82，P=1.23×10-3; rs490514OR=1.22，P=1.96×10-4)。　　我们对本研究中包括各种亚型先心在内的全部病例及全部对照进行合并分析，结果显示rs14005584，rs7863990和rs490514这3个SNPs的突变基因型都能显著增加先心发病风险，而rs2433752的突变基因型则能够显著降低先心发生风险，并且均达到GWAS研究统计学显著水平（rs1400558 OR=1.15，P=1.63×10-9;rs7863990OR=1.34，P=3.71×10-14; rs2433752 OR=0.83，P=1.04×10-10; rs490514OR=1.19，P=1.20×10-13)。此外，我们与英国Cordell课题组合作，欧洲人群中发现rs490514也与欧洲人群先心发病风险显著相关（OR=1.18，P=3.40×10-3）。　　进一步在本研究中涉及的5种主要先心亚型—ASD、VSD、ASD/VSD、PDA以及TOF中对上述的4个阳性SNPs进行分层分析，发现rs2433752和rs490514与5种先心亚型发病风险的关联方向相同，亚组间关联强度无显著异质性（rs2433752异质性P=0.249; rs490514异质性P=0.193）。而对rs1400558和rs7863990的分析结果则显示，它们对不同亚型的效应有显著性差异（异质性P值分别为0.015和0.007）。rs1400558的突变基因型能显著增加其他4种亚型的发生风险，但在对PDA的分析中得到相反的效应方向，关联达不到显著性水平（OR=0.88，P=1.24×10-1）;rs7863990与5种亚型间都有显著关联，与TOF发生风险呈现最强关联效应(OR=1.76，P=5.39×10-7)。　　综上所述，本研究发现了一批新的与中国人群先心发生风险显著关联的易感位点/区域，同时通过分析欧洲人群先心GWAS芯片数据，发现中国人群中的一个遗传易感位点亦与欧洲人群先心风险显著关联，但其他位点不存在明显关联。由此提示，先心遗传易感性在不同种族人群既存在共性，也存在异质性。