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[研究背景]肝癌在恶性肿瘤中,不仅发病率高,且主要集中在亚洲。在中国恶性肿瘤的死亡率中,肝癌高居第二。近年来,随着医疗技术条件的改善,肿瘤病人的存活率有所提高,但是肝癌的发病率和死亡率仍然很高,引起肝癌发生发展的原因和机制仍然不是很清楚。大量研究表明：慢性应激,如慢性炎症、重金属污染、过度饮酒等与肿瘤发展密切相关。酒精已经被证实是促进肝癌进展的危险因素之一但是关于酒精是如何促进肝癌细胞生长和转移的机制仍然不清楚。上皮样细胞向间质样细胞转化的过程,叫做EMT (epithelial-mesenchymal transition)。在肿瘤的发展过程中,EMT使良性的肿瘤细胞浸润到周围组织中,并且转移到远处的组织。转移是90%的肿瘤病人死亡的主要原因。EMT与肿瘤转移密切相关,研究发现Wnt-β-catenin信号通路可以调节EMT,而在肝癌细胞中酒精应激是否通过激活Wnt-β-catenin信号通路诱发EMT从而促进肝癌细胞的生长和转移尚未有明确报道。研究报道,一种可以靶向杀死肿瘤干细胞的药物盐霉素是Wnt-β-catenin信号通路的抑制剂,于是我们设想,是否可以通过使用盐霉素抑制Wnt-β-catenin信号通路从而逆转酒精诱导的EMT。本研究拟探索低浓度的酒精慢性应激是否通过激活Wnt-β-catenin信号通路诱发EMT促进肝癌细胞的恶性进展,并且探究通过使用盐霉素抑制Wnt-β-catenin信号通路是否可以逆转酒精诱导的EMT。[研究方法].为了探讨慢性酒精应激对肝癌细胞恶性进展的影响和机制,本研究用0.2%的酒精长期处理人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721,构建慢性酒精诱导的肝癌细胞模型,通过体外的细胞行为学实验检测低浓度酒精长期慢性处理对肝癌细胞克隆形成能力,集落形成能力、迁移能力的影响；通过体内的裸鼠成瘤实验及饮酒小鼠模型的构建来检测酒精对肝癌细胞体内成瘤能力的影响。于此同时,通过Western blot检测酒精刺激肝癌细胞后EMT相关maker (E-cadherin, Vimentin, β-catenin, MMP-3,MMP-9)的表达情况。通过Western blot、免疫荧光、免疫组化实验检测Wnt-β-catenin信号通路相关分子的激活情况。并且,通过Salinomycin处理肝癌细胞,Western blot检测Wnt-β-catenin信号通路的抑制情况以及EMT相关maker的变化。最后,通过体外的细胞行为学实验和体内的裸鼠成瘤实验,验证Salinomycin对酒精促进的肝癌细胞发生EMT的抑制作用。[研究结果]本研究成功构建了慢性酒精应激的肝癌细胞模型和肝癌动物模型。发现慢性酒精应激在体外促进了肝癌细胞的克隆形成能力、集落形成能力和迁移能力,并且抑制了肝癌细胞由化疗药物引起的细胞凋亡；慢性酒精应激在体内促进了肝癌细胞的裸鼠成瘤能力。同时,我们通过采用慢性酒精应激的肝癌动物模型,发现慢性饮酒促进了肝癌细胞在裸鼠体内的生长和转移。在机制研究方面,我们发现酒精应激可以通过诱发EMT促进肝癌细胞的生长和转移,在肝癌细胞中酒精应激激活了Wnt-β-catenin信号通路,并且发现Salinomycin通过抑制Wnt-β-catenin信号通路可以在一定程度上逆转酒精诱导的EMT。[结论](1)慢性酒精应激促进了肝癌细胞的生长和迁移,抑制了肝癌细胞的凋亡。(2)慢性酒精应激促进了肝癌细胞的裸鼠成瘤能力；慢性饮酒促进了肝癌细胞在裸鼠体内的生长和转移。(3)在肝癌细胞中酒精应激激活了Wnt-β-catenin信号通路。(4)EMT可能参与了酒精应激促进的肝癌细胞恶性进展,Salinomycin通过抑制Wnt-β-catenin信号通路在一定程度上逆转了酒精诱导的EMT。